RNA提取方法是Trizol法。整个过程需要佩戴口罩和手套,用的EP管和移液管枪头都是RNAseFree的,也就是不含RNA酶的,因为RNA酶到处都有,可随时讲解提出的RNA。
一、细胞准备
我本次用的是PC-3细胞(一种前列腺癌细胞系),将细胞种于6孔板(分组情况根据情况设定)。待细胞长满后,用适量PSB洗两次,然后将残留的PBS吸干净。如果怕吸不干净,可将6孔板倒扣在吸水纸上,空干。
二、加入Trizol
将Trizol分别加入到6孔板中,每孔1mL,吹打充分裂解细胞后,将浆液转移至1.5mL的EP管中(用不含RNA酶的EP管),静置5分钟后,4℃ 12000g离心5分钟,将上清转移至新的EP管中。
注:TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,TRIzol中的8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇可以抑制内源和外源RNA酶。
三、加入氯仿
加入1/5体积Trizol的氯仿(CHCl3),我用了1mLTizol,因此这里加入了200μL的氯仿。加入氯仿后,上下翻转混均匀,室温下静置5分钟,12000g4℃离心15分钟,然后将上清液转移至新的EP管中(抽取过程要轻柔,避免将中间的白色沉淀抽入)。
注:氯仿是良好的有机溶剂,可以将有机相和无机相分离,被trizol裂解的细胞各种结合了酚的蛋白质会被溶解在下层的有机相中,而RNA则在上层的无机相中。
三、加入异丙醇
加入0.5~1倍Trizol体积的异丙醇,本次我加入了500μL的异丙醇,震荡后室温静置5分钟,然后12000g4℃离心15分钟,保留沉淀,弃上清。
这一部分目的是将RNA沉淀。
四、加入75%的乙醇
向沉淀中加入与Trizol等体积的75%的乙醇,本次加入1ml乙醇,然后7500g4℃离心5分钟,弃上清,保留沉淀,降EP管倒扣在吸水纸上,尽量干燥。
注:这里用的乙醇是用DEPC水与无水乙醇配置的。此步骤的目的是将沉淀的RNA洗干净。
五、加入DEPC水中溶解
将沉淀溶解于DEPC水中,一般加入30~100μL的DEPC水,可用枪头吹打,促进RNA的溶解,完成整个RNA的提取。再可将样品保存在-20℃或-80℃。