科研抗体标记法如下:
1、直接标记法:
抗体的准备:取提纯的Ig溶液测定蛋白质含量,置于三角烧瓶中加入生理盐水和0.5mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液,冰槽中搅拌5~10min;
荧光素的准备:按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算,准确称取后加入抗体溶液中;
标记:边搅拌边加入荧光素,避免粉末黏附于壁上,置于4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h;
透析:结合完毕后,先将结合物以3000r/min离心20min,除去少量沉淀物后装入透析袋中再置于pH8.0缓冲盐的烧杯中透析过夜;
过柱:取透析过夜的标记物,过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱,分离游离的FITC,收集标记的荧光抗体进行鉴定。
2、间接标记法:
抗体的准备:0~4℃下,用0.01mol/L pH8.0 PBS将待标记的抗体蛋白溶液稀释到浓度为30~40mg/ml,置于三角烧瓶内放入冰槽中;
荧光素的准备:按每毫克蛋白质加入0.01mg的荧光素称取,溶解于等量的3%重碳酸钠水溶液中;将抗体蛋白溶液与FITC溶液等量混合,在0~4℃中搅拌18~24h,充分搅匀;透析或过柱层析。