高通量测序技术——**代测序技术

高通量测序技术是对传统测序一次**性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

自从2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购）推出了454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以来，曾推出过3730xl DNA测序仪（3730xl DNA Analyzer）的AppliedBioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场大份额的公司的地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了两个强有力的竞争对手，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roche GS FLXsequencer)，，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。（见表一）

 

这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列。读取长度根据平台不同从25bp到450bp，不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数，这样庞大的测序能力是传统测序仪所不能比拟的。尽管如此，在这项新的划时代的测序技术刚出现的时候，科学界对这项新技术却并不热衷。许多习惯用桑格技术的科学家怀疑新技术的准确度、阅读能力、成本消费、实用性。代理Sanger型测序硬件的经销商害怕其投资失败而首先提出了这些怀疑。

 

 

然而大多数人却忽略了一个事实，即桑格技术的普及初也遇到同样的阻碍。桑格技术刚开发出来时，阅读能力很难超过25bp，即使在Fred Sanger双脱氧终止法发明后也只达到80bp，如今却达到了750bp；而新发展的合成测序技术，应用焦磷酸测序方法，其阅读能力初只有100bp，推向市场16个月后增加至250bp，随着技术的不断完善，目前已达到了400bp，很快就接近桑格技术目前的水平。除了阅读能力外，能否以有限的成本用一台仪器产生足够数量的序列标记也是另一个需要改善的重要问题。这个问题已经被Roche公司解决了，应用他们的系统，仅花费阅读35bp或者更小片段的成本就能产生比35bp多10倍的序列标记。

       图二：GS FLX 高通量测序方法原理示意图

  一、高通量测序的应用

高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(referencegenome)高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence)，2007年vanOrsouw等人结合改进的AFLP 技术和454测序技术对玉米基因组进行了重测序，该重测序实验发现的超过75%的SNP位点能够用SNPWave技术验证，了一条对复杂基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线。2008年Hillier对线虫CB4858品系进行Solexa重测序，寻找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。但是也应该看到，由于高通量测序读取长度的限制，使其在对未知基因组进行从头测序(novo sequencing)的应用受到限制，这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850碱基)的协助。但是这��不影响高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。

2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA深度测序，这项工作展示了深度测序在转录组研究上的两大进展，表达计数和序列分析。对测得的每条序列进行计数获得每个特定转录本的表达量，是一种数码化的表达谱检测，能检测到丰度非常低的转录本。分析测得的序列，有大于90%的数据显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式，3’端非翻译区，变动的启动子区域以及潜在的小RNA前体，发现至少有3500个基因拥有不止一种剪切形式。而这些信息无论使用芯片技术还是SAGE文库测序都是无法被发现的。

高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中获得了40万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分子和一类全新的小分子RNA。