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琼脂糖凝胶电泳的原理及实验过程

实验原理
琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物，以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下，忽略DNA分子携带的电荷，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。
不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子；聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果很好，且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶，可以分离丌同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大，带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 6V/cm。而对于大片段电泳，可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳，可使用聚丙烯酰胺凝胶。
核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉，但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以综合考虑，多采用 TBE 缓冲液。
核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性，现在大多选择EB替代品进行试验，比较常用的有gelred，goldview，ybr-green等，但是整体效果都若于传统的EB。
材料、试剂及器具
1、材料
合适的Marker（分子量标准）；DNA 样品
2、试剂
加样缓冲液（6x或10x）；琼脂糖；溴化乙锭（EB）。
3、器具
（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。
（2）凝胶成像系统或紫外透射仪。
实验过程
1、按所分离的 DNA 分子的大小范围，选择合适的比例的凝胶，称取适量的琼脂粉，放到一锥形瓶中，加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。待胶液却至 60℃左右，在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。
2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。
3、待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
4、在槽内加入TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。
5、把待检样品，按合适比例与加样缓冲液混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。
6、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节合适电压，稳压输出，开始电泳。
7、观察溴酚兰的带（蓝色）的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时，可停止电泳。
8、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm 或 254nm），通过观察孔进行观察。
注意事项
1、电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致*性物质，务必小心，勿沾染于衣物、
皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。
2、预先加入EB 时可能使 DNA 的运动速度下降15%左右，且不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解，若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加 EB，建议选择EB溶液浸泡染色。
3、加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时**，否则，需重新制胶。
4、电泳时溴酚兰在琼脂糖凝胶中的运动速度可以用于参考电泳速度，已实际电泳条带运动速度为准。

常见问题分析

常见问题	原因	对策
DNA条带模糊	DNA降解	实验过程避免核酸酶污染
	电泳缓冲液陈旧	电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液
	所用电泳条件不合适	电泳时电压不应超过6V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换
	DNA上样量过多	减少凝胶中DNA上样量
	DNA含盐过高	电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分
	有蛋白污染	电泳前酚抽提去除蛋白
	DNA变性	电泳前勿加热，用TE缓冲液稀释DNA
出现片状拖带或涂抹带	PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往PCR体系需要优化，PCR程序需要摸索。	其对策有：调整PCR体系和PCR程序，摸索出合适的条件。
不规则DNA带迁移	电泳条件不合适	电泳时电压不应超过6V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换
不规则DNA带迁移	DNA变性	电泳前勿加热，用TE缓冲液稀释DNA
带弱或无DNA带	DNA上样量不够	增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低
	DNA降解	实验过程避免核酸酶污染
	DNA跑出凝胶	缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
	EB染色的DNA，所用光源不合适	应用短波长（254nm）的紫外光源
DNA带缺失	DNA跑出凝胶	缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
	分子大小相近的DNA带不易分辨	增加电泳时间，核准正确凝胶浓度
	DNA变性	电泳前勿加热，用20mM Nacl 缓冲液稀释DNA
	DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适	在脉冲凝胶电泳上分析
电泳时Ladder扭曲	配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置	同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可
电泳时Ladder扭曲	电泳时电压过高	电泳时电压不应超过6V/CM

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