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DNA合成（DNA synthesis ）技术介绍

蛋白质概念提出：
DNA多肽合成（DNA synthesis ）：按照预定核苷酸的顺序，将脱氧核苷酸逐个进行人工连接合成DNA链的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚体支持物上从3′端延伸核苷酸，可自动化操作。)
目前，oligo DNA合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’®3’方向延伸，而是由3’端开始。
具体的反应步骤如下：
一、保护基 (Deblocking): 用三*** (Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。
二、活化 (Activation): 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体 (其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
三、连接 (Coupling): 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
四、封闭 (Capping): 缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化 (Oxidation) :缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三***脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。
后对其进行切割、脱保护基 (一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化 (常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
上述方法多肽合成的Oligo在脱去保护基后，目的Oligo纯度是极低的，其中含有大量的杂质。主要杂质有：所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基，以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长Oligo DNA含量仅为15%左右。尽管合成时每一步的效率都在97%~98%，但累积的效率并不高。以链长20mer和50mer为例，(97.5%)20»60%、(97.5%)50»28%。可见在粗产品中目的Oligo DNA含量很低，甚至10%都不到。这些杂质，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，不但造成定量不准，还会影响下一步的反应。因此必须对Oligo DNA进行纯化。
目前在DNA合成仪上合成的Oligo DNA主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法进行纯化。该方法纯化的产品纯度较高，可用于绝大部份的分子生物学实验。若考虑节约经费，对于要求较低的实验，如简单的PCR反应，则采用脱盐纯化即可。
Oligo DNA是以OD260值来计量的。在1ml的1cm光程标准石英比色皿中，260nm波长下吸光度为1的Oligo溶液定义为1 OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说,其碱基的组成不尽相同，但1 OD260 Oligo DNA的重量约为33mg，每个碱基的平均分子量约为330 Da。因此合成的Oligo DNA摩尔数可按以下公式近似计算：摩尔数(mmol) = [OD值´33]/[碱基数´330] = 0.1´[OD值/碱基数]

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