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ATP发光技术快速检测食品中菌落总数

摘要】
目的：探讨ATP发光技术快速检测菌落总数的可行性。方法比较ATP生物发光值与平板计数法对**总数进行检测。
结果：检测结果相关性研究分析表明，两者在一定范围内具有显著相关性。
结论：ATP生物发光法操作简便，应用范围广，可应用于对食品中菌落总数的快速检测。

菌落总数是食品微生物国标检测中的一个重要指标，主要是作为判定食品被**污染程度的标志。在国家颁发的食品卫生标准和进口贸易中许多食品的卫生指标都有菌落总数的限量规定。常规的菌落总数检验方法(平板计数法)存在操作繁琐、测试周期较长及检测结果在实际生产的质量控制中意义不大等问题。ATP生物发光测定法是快速检测微生物的方法之一。本文对ATP生物发光测定法与平板计数法的相关性进行了研究分析，并对ATP生物发光测定法进行卫生学检测的可行性和可操作性进行探讨。

1材料与方法

1．1仪器与试剂
ATP生物发光快速检测系统配套仪器及试剂(沈阳中科靓马生物工程有限公司生产)，包括：滨松9505微量光度计、专用比色杯、发光反应试剂(LLR)、**细胞ATP释放试剂(XRA)。旋涡混合器。稀释用磷酸盐缓冲液(PBS)9ml试管分装10管(121℃高温高压**)。固体营养琼脂培养基(121℃高温高压**)。PE手套。大肠杆菌(ATCC25922—3，购于中国药品与生物制品检定所)。恒温摇床。台式离心机。

1．2方法

1．2．1实验准备
计数前1天，用接种环刮取大肠杆菌斜面培养物一环接种到装有40mlLB的100ml三角瓶内，37℃振荡培养过夜。取上述培养物离心(10000r／min，1min)倒去上清液，沉淀用等体积PBS洗涤1次，用同样体积PBS悬浮，此即培养物原液。稀释：(假定培养物浓度约为1×10⁶ cell／m1)用PBS将培养物做10倍递增稀释。

1．2．2平板计数
确定3个用于平皿计数的稀释梯度，保证至少1个梯度的计数在30～300范围内，吸取1ml加人到玻璃**空培养皿中，每个梯度平行倒两个平板，同时做空白对照。于37℃温箱培养48h计数。选择菌落计数在30～300范围内均匀分散的释梯度作平板计数并取其平均值。

1．2．3 ATP测光
提前打开微量光度计屏幕显示RLU为“0”，用**的移液管尖吸取50待测菌液，加入专用比色杯中。将比色杯放人微量光度计抽屉，手持XRA试剂瓶，向比色杯底垂直滴加两满滴XRA。用**的100µl移液管尖，将50µlLLR加入杯中，和缓地吸挤3次，混匀反应液。保持抽吸时间、次数一致。并力求所有样品的这段操作时间一致。关上微量光度计抽屉，此时微量光度计自动进行荧光值测量，等微量光度计显示出荧光值后记录荧光值的大小。

2结果

2．1 ATP测定法与平板计数法试验结果
两种方法测定**总数的两次平行试验结果见表1、表2。

2．2 ATP测定法与平板计数法相关性
依据表1、表2数据，以光值平均数的对数值为Y轴，平板计数平均数对数值为x轴，作x、Y散点图描绘关系曲线，Y=0.8834x—1.6807，R²=0．9778。从数据和散点可以看出，次试验的1O一、**次试验的10^-5、10^-6 3个梯度的值与其他值线性较差，在检测限以外。可以看出，在**数量10cfu／ml以上范围内平板计数与生物发光值成显著相关。

3讨论

ATP生物发光法检测灵敏度高，试验中发现受试液颜色、操作及非**ATP对发光强度均有影响，但对总体发光强度的影响都<0．9％。从待测样品的制备到**ATP的提取，直到ATP发光强度的检测，整个过程可在lh内完成，具有快速、简便的特点，可以满足一般快速检测的要求。ATP发光技术能达到的检测极限为l0^-15 molATP，相应的**总数应在10³cfu��ml以上，样品卫生指标标准在10³cfu／ml以上的可即时得出样品**总数数量判断质量好坏。而微生物检验卫生指标在10³cfu／ml以下，可采用适当简便的富集技术，使样品菌落总数达到有效检测范围，而该技术也是ATP发光技术能应用于卫生检验的关键。近年来，虫荧光素酶已通过基因工程生产，价格大幅度减低，随着相关仪器的小型化，ATP生物发光技术必将会在相关行业得到迅速普及。

（马妮赵虹中国卫生工程学）

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