皮质醇 ELISA 试剂盒（Cortisol ELISA Kit）
1. 检测原理
本试剂盒采用**竞争性酶联免疫吸附试验（Competitive ELISA）**原理，用于定量检测血清、血浆、唾液、尿液等样本中的皮质醇（Cortisol）含量。
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包被抗原：微孔板预包被皮质醇-蛋白结合物。
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竞争结合：样本中的皮质醇与酶标皮质醇（HRP 标记）竞争结合有限量的抗皮质醇抗体。
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显色反应：加入 TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物后，HRP 催化显色，颜色深浅与样本中皮质醇浓度成反比。
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终止反应：加入终止液（稀硫酸）后，在 450 nm（参考波长 630 nm）处测定吸光度（OD 值）。
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2. 适用范围
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样本类型：人/动物血清、血浆（EDTA/肝素抗凝）、唾液、尿液、细胞培养上清液等。
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应用领域：
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**诊断（库欣综合征、Addison 病、应激状态评估）。
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科研实验（HPA 轴功能研究、药物代谢分析）。
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3. 试剂盒组成
| 组分 | 规格 | 保存条件 |
|---|---|---|
| 预包被微孔板 | 96 孔（可拆卸） | 2-8°C（干燥） |
| 皮质醇标准品（0, 1, 5, 20, 50, 100 ng/mL） | 6 管 × 1 mL | -20°C（避免反复冻融） |
| 酶标结合物（HRP-皮质醇） | 1 瓶 × 12 mL | 2-8°C（避光） |
| 抗皮质醇抗体 | 1 瓶 × 6 mL | 2-8°C |
| TMB 底物液 | 1 瓶 × 12 mL | 2-8°C（避光） |
| 终止液（1M H₂SO₄） | 1 瓶 × 12 mL | 室温 |
| 洗涤缓冲液（20×浓缩液） | 1 瓶 × 50 mL | 室温（稀释后 2-8°C 保存） |
4. 样本采集与处理
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血清/血浆：静脉采血后离心（3000 rpm，10 min），避免溶血。
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唾液：使用专用唾液采集管，离心（10,000 rpm，5 min）去除颗粒物。
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尿液：收集 24 小时尿或晨尿，调整 pH 至 7.0，离心后取上清。
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储存：
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短期（≤7 天）：2-8°C。
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长期：-20°C 冻存（避免反复冻融）。
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5. 实验步骤
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试剂准备：
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洗涤缓冲液：1×PBS-T（1:20 稀释浓缩液）。
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标准品/样本恢复至室温（20-25°C）。
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加样与孵育：
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每孔加入 50 μL 标准品/样本 + 50 μL 酶标结合物 + 50 μL 抗体溶液。
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轻轻混匀，37°C 孵育 60 分钟。
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洗涤：
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弃去孔内液体，每孔加 300 μL 洗涤液，静置 30 秒后弃去，重复 5 次。
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显色：
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每孔加入 100 μL TMB 底物，避光室温反应 15 分钟。
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终止与读数：
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每孔加入 50 μL 终止液，立即在酶标仪读取 450 nm OD 值（参考波长 630 nm）。
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6. 数据分析
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标准曲线绘制：
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以标准品浓度（ng/mL）为横坐标（Log 刻度），对应 OD 值为纵坐标，拟合 4 参数逻辑曲线（4PL）。
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样本浓度计算：
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根据标准曲线方程，计算样本中皮质醇浓度。
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单位换算：1 ng/mL = 2.76 nmol/L。
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7. 注意事项
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实验环境：室温（18-25°C），避免强光直射。
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交叉污染：更换吸头避免标准品/样本间污染。
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干扰因素：
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溶血、脂血样本需预处理。
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某些药物（如糖皮质激素、避孕药）可能影响结果。
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质量控制：
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每批次实验需包含 空白孔（0 标准品） 和 质控样本。
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复孔检测 CV（变异系数）应 ＜10%。
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8. 参考范围
| 样本类型 | 正常范围（晨间） |
|---|---|
| 血清/血浆 | 5-25 μg/dL（138-690 nmol/L） |
| 唾液 | 0.1-1.0 μg/dL（2.8-27.6 nmol/L） |
| 24 小时尿 | 10-100 μg/24h（28-276 nmol/24h） |
9. 储存与稳定性
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未开封试剂盒：2-8°C 保存，有效期 12 个月。
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开封后：
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酶标板：密封后 2-8°C 保存，1 个月内使用。
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标准品/抗体：-20°C 分装保存，避免反复冻融。
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10. 局限性
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昼夜节律影响：建议固定采样时间（如上午 8-10 点）。
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高浓度样本：需适当稀释后复测。
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ELISA 与 LC-MS/MS 差异：ELISA 可能存在交叉反应，必要时用质谱法验证。
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本说明书仅提供通用操作指南，具体实验条件需根据实际试剂盒优化。以上内容仅供参考。
