实验流程--ELISA 间接ELISA 1．溶液准备： 包被液：50mM Na2CO3 ( pH9.6 ), 20mMTris-HCl ( pH8.5 ) 或10mM PBS ( pH7.2 )封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 ( pH7.4 ) 2．实验程序： 1 ) 将抗原按适当浓度溶解于包被液中。 2 ) 在对应的孔中加入100μl抗原，室温孵育2h或4℃过夜。 3 ) 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 4 ) 每个孔中加300μl封闭液，孵育1h。 5 ) 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 6 ) 每个孔中加100μl一抗，37℃孵育1h或室温孵育3h。 7 ) 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 8 ) 每个孔中加100μl二抗，室温孵育1h。 9 ) 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 10 ) 用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体，这次的洗涤步骤对于减少背景信号是很重要的。 11 ) 每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。 12 ) 每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405-410nm读数。 夹心ELISA 1． 溶液准备： 包被液：50mM Na2CO3 ( pH9.6 ), 20mMTris-HCl ( pH8.5 ) 或10mM PBS ( pH7.2 )封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 ( pH7.4 )AKP偶联的链球菌亲和素溶液：用1×封闭液稀释酶偶联物 2． 实验程序： 1 ) 将捕获抗体包被液稀释至相应的浓度。 2 ) 在对应的孔中加入100μl抗体溶解液，室温孵育2h或4℃过夜。 3 ) 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 4 ) 每个孔中加300μl封闭液，孵育1h。 5 ) 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗脱液清洗两次。 6 ) 每个孔中加100μl生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h或室温孵育3h。 7 ) 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 8 ) 每个孔中加100μl AKP偶联的链球菌亲和素，室温孵育1h。 9 ) 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗脱液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 10 ) 用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体，这一步对于减少背景信号是很重要的。 11 ) 每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。 12 ) 每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405-410nm读数。
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