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基因脉冲导入技术及应用

基因脉冲导入技术及应用
基因脉冲导入技术及应用*

生命科学仪器2005第3卷/第5期

孙云1,2，苏明皓2，袁其平1，童峥嵘2，徐宝强2
（1.中国民航学院,天津300300；2.天津理工大学光电信息与电子工程系,天津300191）

摘要    本文首先介绍了细胞电穿孔的基本原理和天津理工大学自行研制的基因脉冲导入仪，重点介绍了细胞电穿孔诱导基因转移在动物细胞、植物细胞、**、酵母上的应用及电穿孔技术的一些特殊应用。基因脉冲导入技术应用前景十分广泛。

关键词基因脉冲导入，细胞电穿孔，膜电位

1细胞电穿孔的基本原理
    细胞电穿孔是一种新型生物物理新技术，它可使细胞可逆穿孔，从而导入外源RNA、DNA蛋白分子和各种小分子，产生具有新的生物性状的转化细胞株。该技术具有高效率、低毒性、普适性和可控性的特点，在细胞工程和基因工程等方面具有广泛应用。
    设细胞为球形，悬浮在溶液里并处于电场中。电场诱导的膜电位可由下式表示：
V=1.5αEcosθ
  （1）式中α是细胞的半径，E是外加电场强度，θ是经过细胞膜任意一点的径向与电场方向之间的夹角。对于细胞的两个极点θ=0°或θ=180°，外加电场诱导的膜电位可进一步简化为：Vdp=1.5αE  （2）
     随着外加电场强度的增大，在细胞膜上诱导的膜电位也随之增大。当增大到一定程度，细胞膜将出现电穿孔现象。此时的诱导膜电位Vcr叫临界膜电位，Ecr叫做临界外加电场。一般认为，外加场强为1～10KV/cm、电脉冲的持续时间在1μs～10ms时细胞膜会出现微孔。
     公式（1）是细胞电穿孔的理论基础，又是实际应用的依据。但是实际情况是非常复杂的。例如，所有细胞都不是理想的球形，不同细胞形态各异、大小不同，就是同一种细胞的大小、形状也有区别；不同细胞膜组分有所不同，不同的培养条件以及细胞悬浮液成分不同造成生理条件不同等，对电穿孔都有不同程度的影响。因此公式不能给出准确值，只能给出参考值，应用中的实际电场强度仍需由实验来确定。

2导入技术
2.1导入技术的介绍
     基因脉冲导入仪的主要功能是产生一个高电压、大电流指数规律的尖脉冲。其主要组成包括高压脉冲产生器、微机控制板和电极小池。
无论在高阻或低阻（例如含盐或蔗糖缓冲液）情况下都可以正常工作，可用于植物、动物和各种微生物的各类细胞电穿孔，并能得到很高的转化率。该仪器用电击法和传统法相比简单易行，省时间，效率高，达到国外同类产品的一致效果。
    根据客户要求在原有产品基础上我们又做了改进，研制出LN-201、301系列产品。LN-301系统框图如图2所示。该仪器采用点阵式LCD显示，能够同时显示多个信息，可做到汉字、字符同屏，便于用户的操作和使用。系统可单脉冲和多脉冲两种功能，便于用户的选择使用。组合电容由0.5、1、2、4、8、10μF的6个电容组合而成，可根据用户的需要自由地组合。为了避免高压放电对单片机的干扰，采用了数字地和模拟地各自独立的方式，使该仪器的稳定性、可靠性得到较大的提高。
    与此配套的放电小池有1mm、2mm、4mm三种不同规格的放电小池。其中2mm、4mm小池的电极有粘贴型的，1mm、2mm小池电极有采用工字铝注塑型的。
2.2电极改进
    在原有各种电解小池的基础上，为了更好的满足客户在基因**和临床医学方面的要求，我们又提出针状电极代替放电小池的方案，研制出各种放电电极如用于动物原地**注入（**增敏）和转基因的针状电极（平行和梅花形）。四川大学实验表明，当一定强度的瞬态电磁脉冲作用于细胞体时，在细胞膜上将形成瞬时微孔，促进**等大分子进入细胞液。利用电穿孔结合******在昆明小鼠上接种和生长的S-180肉瘤，结果证明，这种方法可以明显的抑制肿瘤细胞的生长。中国医学科学院整形医院，用针状和平板的组合电极，实验进展很顺利，取得了很好的效果。

3技术应用
3.1电穿孔诱导基因的应用
  （1）电穿孔诱导基因转移在动物细胞上的应用利用电穿孔技术转化动物细胞杂种已成为许多实验室一种有效的常规手段。电穿孔转化率比传统方法要高数倍至上千倍。对贴壁生长的细胞，可以在单层培养物上进行原位基因电转移，不仅操作简便，且转移效率较高[1]。动物细胞电转移不仅广泛应用于各种转化细胞株，而且为遗传病的基因**了良好的前景。
  （2）电穿孔诱导基因转移在植物细胞上的应用
它可以高效地把外源DNA或RNA摄取到受体细胞，建立起转化新株。例如将质粒pCMC1020导入大豆原生质中，已选择出转化愈伤组织，并生长出根[2]。
   又将pD23和pMP1质粒导入玉米原生质中经选择培养已获得转化植株[3][4]。植物电穿孔可以获得耐寒、耐旱、抗虫、抗病毒等品种。
  （3）电穿孔诱导基因转移在**上的应用[5]
    **电穿孔基因转移应用研究近几年来有了很大的发展，目前已有100多种**能成功地进行基因电转移。
    天津医科大学**附属医院将质粒D N A和噬菌体DNA成功地转化或导入大肠杆菌。该电场单次电压脉冲范围1.0 k V/2.5 k V（初电场强度2.8kV/cm～16kV/cm）、电容范围为5～20μF，用质粒p U C 1 8和受体菌株D H 5α，获得转化率为109～1010/μgDNA。
（4）电穿孔诱导基因转移在酵母上的应用
    酵母细胞电穿孔诱导基因转移，如能把有关的目的基因转移到细胞而得到表达，并能筛选出所需要的菌株，则对制药业、酿造业和轻工业起到巨大推动作用。
复旦大学生物化学系成功地进行了青岛海葵强心多肽在枯草杆菌和毕氏胶木中的分泌表达研究。
3.2电穿孔技术的特殊应用
  （1）电插入法将蛋白分子
    插入细胞膜当外加电场大于或等于临界值时，在细胞膜上形成亲水的孔洞，贯通于细胞内外。而当外加电场稍小于临界值，但可将外源蛋白质插入细胞质膜，而不造成明显的损伤。这种新颖的方法叫电插入法。例如将CD4受体插入红细胞膜上，不仅可以延长受体的循环生活期，而且了一种**艾滋病的方法[6]。
  （2）将蛋白分子导入细胞
    在佳条件下，电穿孔可使细胞损伤小，而又使细胞有效地通透，将内切酶抗体等导入细胞。例如将肿瘤天门冬酰胺合成酶的单克隆抗体导入SHU**细胞和人成纤维细胞HT-5K，细胞成活率达80%～90%，而且90%的活细胞结合了抗体[7][8]。
  （3）建立基因库
    电穿孔技术现已公认是在原核细胞中进行基因转移的有效的手段。对一些好的菌株，其转化率高达1010/μgDNA，从而仅用少量DNA即可构建综合的基因库。Dower等利用电穿孔方法已经开发构建大于109个独立重组的质粒库[9]。
  （4）在原位研究酶的活性
   例如海胆卵在受精过程中，其生理活性增强，而酶是影响新陈代谢的因素，研究酶调节机制是令人感兴趣的问题，电穿孔对细胞完整的干扰小，可以把带标记的底物导入细胞，进行酶活性的研究[10]。
（5）基因靶定向
    在通常情况下，导入哺乳动物的DNA在细胞内基因组由非同源重组整合到非特定位置上。导入的DNA也可以偶然地由同源重组直接整合到特定位置。这种同源重组称为基因靶定向。基因转移效率越高，同源重组体就越多。而电穿孔方法了一个快速、高效的将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法，使之能很容易的产生大量的细胞转化体，成为基因靶定向中诱导DNA进入细胞的一个值得推荐的方法。

参考文献
[1]Raptis,L.,andFirth,K.L.,1990DNACellbiol.9:615-621
[2]Christon,P.,et al.,1987,PNAS USA.84:3962-3966
[3]Rhodes.C.A.,etal.,1988Science240:204-207
[4]Allen,S.P.andBlaschek,H.P.,1990,FEMSMicrobriol.Lett.70:217-220
[5]宋诗铎、张同海、祁伟、赵为诚、徐宝强、刘建民应用电激法在大肠杆菌中导入外源性DNA生物工程学报1993，9（3）：237-240
[6]Zeira,M.,etal.,1991,proc.Natl.Acad.Sci,USA.88:4409-4413
[7]Chakrabarti,R.,1989,J.Biol.Chem.264:15494-15500
[8]BerglandD.L.,andStarkey,J.R.,1991,Cylometry12:64-67
[9]Dower,W.J.,and Cwirla,S.E.,1992,in“Guide to Electroporation and Electrofrsion ”Chang, D.C.,etal.,editors Academic press,Ssn Dieago p291-301
[10]Swezeg,R.R.,and Epel,D.,1992,同上，p347-361

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