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凝胶迁移实验
1.探针的标记:
(1) 如下设置探针标记的反应体系:
待标记探针 (1.75pmol/微升) 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升
T4 Polynucleotide Kinase (5-10U/微升) 1微升
总体积 10微升
按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混匀。
(2) 使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。
(3) 加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。
(4) 再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。
(5) 标记好的探针好立即使用,长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
2.探针的纯化:
通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化,可以按照如 下步骤操作:
(1) 对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙醇,混匀。
(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过一夜。
(3) 在4℃,12000g-16000g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉。
(4) 在4℃,12000g-16000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。
(5) 加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针好立即使用,长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存于-20℃。
上海嘉鹏科技有限公司专业生产:紫外分析仪、三用紫外分析仪、暗箱式紫外分析仪、暗箱三用紫外分析仪、暗箱紫外分析仪、手提式紫外分析仪、三用紫外分析仪暗箱式、紫外检测仪、部分收集器、恒流泵、蠕动泵、凝胶成像系统、凝胶成像分析系统、化学发光成像分析系统、光化学反应仪、旋涡混合器、漩涡混合器、玻璃层析柱、梯度混合器、梯度混合仪、核酸蛋白检测仪、玻璃层析柱、荧光增白剂测定仪、馏分收集器、切胶仪、蓝光切胶仪、层析系统等产品。欢迎来电咨询。
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