[方法和步骤]（一）消化1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶剂1.0mL，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g，浓硫酸2.0mL，30%过氧化氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定运行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水1.0mL代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶剂澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中运行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。（二）蒸馏和吸收蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内运行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。1、仪器的洗涤仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶剂中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石（或毛细管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸气只能进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸没在溶剂中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶剂是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。2、无机氮指标样品的蒸馏吸收由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，初学者宜先用无机氮指标样品运行反复练习，再运行有机氮未知样品的测定。常用巳知浓度的指标硫酸铵测试三次。取洁净的100mL锥形瓶五只，依次加入2%硼酸溶剂20mL，次甲基蓝-甲基红混合指示剂（呈紫红色）3～4滴，盖好瓶口待用。取其中一只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶剂中。注意：在此操作之前必须先打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取2mL硫酸铵指标液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶剂慢慢流入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3次，一并放人蒸馏瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30％NaOH溶剂，使碱液慢慢流入蒸馏瓶中，在碱液尚未完全流入时，将棒状玻塞盖紧。向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使一半水流入蒸馏瓶，一半留在小玻杯中作水封。关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，运行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色时起，再蒸馏3～5min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。在一次蒸馏完毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集器间的橡胶管，排除反应完毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。如此反复冲洗干净后，即可运行下一个样品的蒸馏。按以上方法用指标硫酸铵再做两次。另取2mL蒸馏水代替指标硫酸铵运行空白测定二次。将各次蒸馏的锥形瓶一起滴定。3、未知样品及空白的蒸馏吸收将消化好的蛋白样品三支，空白对照液三支，依次作蒸馏吸收。加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次，每次用水量约3mL，洗涤液一并倒入反应室内。其余操作按指标硫酸铵的蒸馏运行。由于消化液内硫酸钾浓度高而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，必须加入热蒸馏水5 mL稀释之，如果有结晶析出，必须微热溶解，趁热加入玻杯，使其流入反应室。此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未完全冷却时立即加入样品或空白对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，造成堵塞。（三）滴定样品和空白蒸馏完毕后，一起运行滴定。打开接受瓶盖，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的指标盐酸溶剂运行滴定。待滴至瓶内溶剂呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇后复现绿色，应再小心滴入指标盐酸溶剂半滴，振摇观察瓶内溶剂颜色变化，暗灰色在一二分钟内不变，当视为到达滴定终点。若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定耗用的指标盐酸溶剂用量中减去0.02mL，每组样品的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶内的溶剂颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。记录每次滴定耗用指标盐酸溶剂毫升数，供计算用。三. [结果与计算]运算下列公式计算出每次无机氮指标样品和未知样品的总含氮量。式中WN——每毫升样品的含氮毫克数；A——滴定样品消耗的盐酸量（mL）；B——滴定空白消耗的盐酸量（mL）；C——测定样品所取用量（mL）；0.0100——指标盐酸物质的量浓度（mol/L）；14.008——每摩尔氮原子质量（g/mol）。三次样品测定的含氮量相对误差应小于±2%。样品粗蛋白含量＝总氮量× 6.256.25为含氮量换算为蛋白质含量的系数。.这个系数来自蛋白质平均含氮量为16％，实际上各种蛋白质因氨基酸组成不同，含氮量不完全相同。乳类为6.38，大米为5.95，花生为5.46等凯氏定氮法的缺陷：从凯氏定氮原理可以知道：凯氏定氮法是将含氮有机物转变为无机氮硫酸铵来运行检测，以得到含氮量的测定值乘以一定系数得出蛋白质含量。而含氮有机物不仅仅是蛋白质，还有三聚氰胺 等等。在加上食品中蛋白质含量的现行国家指标和国际通行测定方法是经典凯氏定氮法，这就为造假者提供了可乘之机。蛋白质中的含氮量不超过30％，三聚氰胺的*大的特点是含氮量很高（66％），溶于水后无色无味，也就是说在一杯清水中加入三聚氰胺，然后用凯氏定氮法检测，结果显示是含有蛋白质的。由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量,并不能鉴定饲料中有无违规化学物质,所以,添加三聚氰胺的奶粉理论上可以测出较高的蛋白质含量。视频地址http://v.youku.com/v_show/id_XNzExNDIwMzI=.html