蛋白质分离纯化方法有哪些?
1、 盐析
实验原理:中和蛋白质表面电荷并破坏水化膜。
蛋白质易溶于水,因为其分子的-COOH -NH2和-OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1~100 nm大小的亲水胶体,从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。当大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的 SO42- 和NH4+)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之"失水",于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
2、等电点沉淀法
实验原理:利用蛋白质在等电点时溶解度*低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。
在等电点时,蛋白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度*小,*易形成沉淀物。
注意点:不同的蛋白质,具有不同的等电点。同一种蛋白质在不同条件下,等电点不同。
3、有机溶剂沉淀法
实验原理:加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低,因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力,促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似,有机溶剂与蛋白质争夺水化水,致使蛋白质脱除水化膜,而易于聚集形成沉淀。
影响因素:(1)有机溶剂的选择 (2)温度的控制 (3)pH值 (4)离子强度
用此法析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降,分离后的蛋白质沉淀应立即用水或者缓冲液溶解,以达到降低有机溶剂的浓度的目的。此法在血液制品的制备过程中较多使用。