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蛋白质技术专题：蛋白等电聚焦凝胶电泳技术（一）

1.原理

等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。
等电聚焦中，只有在凝胶两端给以高电压时，才能获得较好的蛋白质条带分辨率，这就需要非常有效的凝胶冷却系统（否则会导致烧胶），即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高，并可方便的同时比较多种蛋白质样品，所以平板胶用在等电聚焦上的居多。
由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感，若要好的重复性，制备蛋白样品时一定要小心，要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外，蛋白质－脂类、蛋白质－蛋白质相互作用可引起电荷改变，进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质－蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能，等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。

2.主要仪器、试剂

仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器
试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三***、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三***；4）1%三***；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；

3.载体两性电解质的选择

载体两性电解质是一些具有相近等电点的分子量为600－900Da的多氨基多羟基两性化合物的混合物，下面时配置不同pH范围等电聚焦凝胶的载体两性电解质的配方：

4.灌胶

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。

水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10％过硫酸胺25μl； TEMED：20μl

灌胶步骤：1）组装灌胶器；2）将尿素、水、溶液1）和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3）加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4）将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5）插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6）聚合约1小时；7）聚合完成，小心拔去梳子；8）将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。

注意：1）上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2）现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.

样品制备和上样：
一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔大上样量大约15μl。

变性凝胶上样缓冲液2×Buffer（适用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10载体两性电解质：20μl；3）pH4-6载体两性电解质：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巯基乙醇：50μl；双蒸水：1.7ml；1％溴酚蓝：200μl

5.电泳

操作步骤：

1）将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合，10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀；2）用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部，注意不要溢出来。注意：对于考马斯亮蓝染色液来说，每个泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我们俗称粗抗原）或者5-10ug单一蛋白组分是较合理的上样浓度。

电泳液：

1）上槽中加入阴极电泳液（20mM氢氧化钠：须由1M储存液新鲜配置）；

2）下槽中加入阳极电泳液（10mM磷酸：须由1M储存液新鲜配置）。

等电聚焦电泳条件：

1）接好电极；

2）恒压150V电泳30min；

3）恒压200V电泳2.5h，开始时候控制电流为10mA左右，在聚焦过程中电流有所下降，电泳内室温度在电泳的过程中将升至40－50摄氏度。

6．电泳聚焦后处理

测定pH梯度：

1）将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；

2）将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中浸泡30min；

3）测读此KCl溶液的pH值、

凝胶的固定：

1）将凝胶于10%三***中浸泡10min；

2）换成1%三***溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。

凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。

7.天然等电聚焦电泳的修正方案

如果要进行天然等电聚焦电泳，要做一些修改；

1）胶过程中配的凝胶中不需要加尿素；

2）上样缓冲液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl载体两性电解质（同制胶成分），3ml甘油，上样时候于等体积样品混匀，10000×g离心5敏即可上样；

3）室温下电泳，接好电极，恒压下先200V电泳1.5h，再400V电泳1.5h。

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