蛋白质纯化方法经典攻略（二）

亲和层析的固定相是一种共价结合特异性配体的惰性介质，该配体可与一个蛋白质或一类蛋白质特异性结合。惰性介质通常是交联的琼脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白质可采用选择性或非选择性模式来进行亲和柱层析纯化。在选择性亲和柱层析中，一般使用对蛋白质有特异性作用的配体或共价结合的标签。在非选择性亲和柱层析中，如用于免*疫球蛋白纯化的蛋白A、G、L，用于DNA结合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，这些配体与一类蛋白都具有相似的结合能力。

图 4. 用蛋白A、G、L进行亲和层析的原理示意图：A.抗体含有多个功能区：一类蛋白质的Fc区（片段，恒定区） 都是相同的，Fv区（片段，可变区）是每个抗体各不相同的特异区，Fab（片段，抗原区）是抗体实际与特异性抗原结合的区域。B.抗体的特异性区域可以通过亲和色谱进行非选择性纯化，在该过程中，配体 （蛋白 A、G、L）是结合在分离介质上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于纯化特异性蛋白。这种情况下，抗体作为中间配体为其抗原提供选择性。

两类亲和色谱中，在不影响蛋白质（或标签） 和配体间作用力的条件下，蛋白质均在柱上保留。在不破坏特异性相互作用但可破坏所有杂蛋白与固定相间其非特异性作用的条件下，对所有结合的蛋白质进行淋洗。*后用含有竞争分子的缓冲液或者可破坏所有蛋白质间相互作用的条件对结合蛋白进行洗脱。
竞争分子可代替目标蛋白与配体相结合。这种竞争分子可通过其他层析手段或者透析的方式从目标蛋白中去除。通过破坏所有蛋白间相互作用来从固定相洗脱蛋白的方法包括调节缓冲液的pH值或者离子强度。因为这些方法同样会影响蛋白质的稳定性，因此通常建议洗脱下来的蛋白质要立即中和或者稀释以将危害降到*小。有报道称，对于不同形式的亲和层析，为获得*高产率的活性蛋白需采用多种不同的流动相条件  。