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PCR扩增产物鉴定与纯化实验原理及实验过程

实验原理
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。（原理参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验）

本实验使用了TaKaRa公司的胶纯化试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit），该试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便的特点，全套操作只需30min便可完成。使用该试剂盒每次可纯化得到多至10µg的DNA片段（100bp～30kb），回收率高达50～80%。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。

经胶纯化试剂盒回收的DNA片段采用-20℃低温保存，延缓DNA的降解。

实验试剂
1. PCR扩增产物
2. Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)
3. 琼脂糖
4. 1×TAE
5. 6×Loading Buffer
6. DNA Marker 2000

实验设备
1. 琼脂糖凝胶电泳系统
2. 紫外透射仪
3. 台式离心机
4. 移液枪（配套枪头）
5. -20℃低温冰箱
6. 分析天平

实验材料
1. 单面刀片
2. 纯化试剂盒
3. 1.5mL离心管
4. 超纯水（无菌）

实验步骤
1. 使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。（参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验）

2. 在紫外灯下切出含有目的DNA（约600bp）的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

注意：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。

3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。

4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1µL进行计算。

5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表：

凝胶浓度 DR-I Buffer 使用量
1% 3个凝胶体积量
1%-1.5% 4个凝胶体积量
1.5%-2% 5个凝胶体积量

6. 均匀混合后75℃加热，融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10分钟）。

注意：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。

7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1min，弃滤液。

注意：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

10. 将500 µL的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30s，弃滤液。

11. 将700 µL的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm离心30s，弃滤液。

12. 重复操作步骤11。

13. 将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 µL的**蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

注意：使用加热至60℃的**蒸馏水或Elution Buffer有利于提高洗脱效率。

14. 12000 rpm离心1min洗脱DNA。

-20℃低温保存纯化的目的DNA片段。

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