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测序仪进行pcr测序反应的操作步骤

　　测序仪进行pcr测序反应的操作步骤：

　　(1) 取0.2ml的pcr管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：

　　所加试剂测定模板管标准对照管

　　bigdye mix 1μl 1μl

　　待测的质粒dna 1μl －

　　pgem-3zf (+) 双链dna － 1μl

　　待测dna的正向引物 1μl －

　　m13(-21)引物－ 1μl

　　**去离子水 2μl 2μl

　　总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧pcr管，用手指弹管混匀，稍离心。

　　(2) 将pcr管置于9600或2400型pcr仪上进行扩增。98℃变性2min后进行pcr循环，pcr循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

　　(3) 醋酸钠/乙醇法纯化pcr产物

　　(4) 电泳前测序pcr产物的处理

　　(5) 分析或打印出彩色测序图谱

　　(6) 序列分析：仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率

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