产品名称：泰乐菌素和替米考星ELISA检测试剂

【简 介】 本试剂盒适用于肌肉（猪、鸡、鱼、牛，羊）、肝脏（猪、鸡、牛，羊）、蜂蜜、牛奶、鸡蛋中泰乐菌素和替米考星的残留检测。 【原理】 本试剂盒采用间接竞争ELISA原理检测泰乐菌素和替米考星残留。 检测时，包被有包被抗原的酶标板的每一孔中先后加入标准品或样品处理液，抗体工作液，游离的泰乐菌素或替米考星与固定在酶标板上的半抗原竞争抗体结合位点。通过洗涤，与酶标板上半抗原结合的抗体被吸附在酶标板上，而游离**与抗体的结合物被除去。然后加入酶标二抗，通过孵育，洗涤，加入底物等步骤，*后加入终止液使颜色由蓝色转变为黄色，在450nm处测量吸光值。吸光值与样品中**的浓度成负相关。 【技术参数】 *低检测限 猪肉————20ppb； 猪肝————20ppb； 鸡肉————20ppb； 鸡肝————20ppb； 羊肉————20ppb； 羊肝————20ppb； 牛肉————20ppb； 牛肝————20ppb 鱼肉————20ppb； 蜂蜜————20ppb； 牛奶————10ppb； 鸡蛋————20ppb 交叉反应率 替米考星———————————100% 泰乐菌素 ——————————180% 回收率 各种组织回收率在60%至120%之间。 精密度 本试剂盒板内板间变异系数<15% 【试剂盒提供的材料】 酶标板1×96孔/板 1块 浓缩洗涤液50 mL (10×)/瓶 1瓶 标准品溶液 0、2.5，5、10、20、40ng/mL 6瓶 抗体液 6 mL/瓶 1瓶 酶标抗体液 12 mL/1瓶 1瓶 底物液 12 mL/瓶 1瓶 终止液 7 mL/瓶 1瓶 【检测需要但不提供的仪器与试剂】 仪器 酶标仪（配有450nm滤光片）；氮气吹干装置；恒温箱（37℃）；均质器；离心机； 漩涡仪；电子天平（感量0.01g）； 器材 容量瓶（100 mL，1000 mL）； 刻度移液管（10 mL）； 聚苯乙烯离心管（10 mL、50 mL）、 单道微量移液器（20μL ~ 200μL、100μL ~ 1000μL）； 多道微量移液器（50μL ~ 300μL）。 试剂 偏磷酸；氯仿；正己烷；甲醇；去离子水 其他 洗耳球；加样槽；吸咀(300ml、1000ml)。 【检测所需工作液配制】 （1）洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水10倍稀释后使用，室温保存。 （2）pH6.0磷酸盐缓冲液：KH2PO41.25g，Na2HPO4.12H2O 0.28g，加去离子水搅拌溶解，定容至1000ml，室温保存。 （3）pH调节液：准确称取10g氯化钠，2.42g Tris（三羟甲基氨基甲烷），加去离子水搅拌溶解，6M HCl调pH至9.0，定容至100 ml，室温保存。 （4）底物液配制：根据每次所需用量，取适量的底物A液与B液按1:100的比例混匀，现配现用。 （5）0.3%偏磷酸溶液：准确称取3g偏磷酸，500ml去离子水煮沸溶解，定容至1000ml，室温保存。 （6）组织提取液：量取600ml 0.3%偏磷酸溶液，400ml甲醇，混匀后即为组织提取液，室温保存。 （7）标准溶液配制：准确吸取60μL 1mg/ml替米考星母液于5.94ml甲醇溶液中，旋涡混匀2min，即为10ug/ml替米考星标准溶液。准确吸取1ml 10ug/ml替米考星溶液于9mlpH6.0磷酸盐缓冲液中，旋涡混匀2min，即为1ug/ml替米考星溶液。 准确吸取400μL 1ug/ml替米考星溶液于9.6mlpH6.0磷酸盐缓冲液中，旋涡混匀2min，即为40ng/ml标准溶液。准确吸取5ml 40ng/ml替米考星溶液于5mlpH6.0磷酸盐缓冲液中，旋涡混匀2min，即为20ng/ml标准溶液。依次倍比稀释为10、5，2.5ng/ml。 【样品处理方法】 所有样品应于2~8℃避光冷藏保存。 1.（猪、鸡、鱼、牛、羊）肌肉，（猪、鸡、牛、羊）肝脏，蜂蜜 （1）称取均质样品2.0 g ± 0.02 g于50 mL离心管中； （2）加入组织提取液10 mL，漩涡5min，4000 rpm室温离心5min； （3）取上清液1mL于10 mL离心管中，加入1 mLpH调节液，加入5ml氯仿，漩涡混匀1min； （4）4,000 rpm室温离心5min；取下层氯仿于另一10ml离心管，40 ℃ ± 5 ℃水浴，氮气吹干； （5）加入2ml正己烷，样品稀释液2mL，漩涡1min； （6）4,000 rpm室温离心1min； （7）吸尽上层正己烷层和中间浑浊层，取下层澄清水相300μL于EP管中，取50ul检测。 （样品可4℃避光短暂保存；样品稀释倍数为12） 2.牛奶 （1）称取牛奶样品2.0 g ± 0.02 g于50 mL离心管中； （2）加入组织提取液10 mL，漩涡1min，4,000 rpm室温离心5min； （3）取上清液1mL于10 mL离心管中，加入1ml pH调节液，4ml氯仿，漩涡混匀1min； （4）4,000 rpm室温离心5min；取下层氯仿于另一10ml离心管，40 ℃ ± 5 ℃水浴，氮气吹干； （5）加入2ml正己烷，样品稀释液1mL，漩涡1min； （6）4,000 rpm室温离心1min； （7）吸尽上层正己烷层和中间浑浊层，取下层澄清水相300μL于EP管中，取50ul检测。 （样品可4℃避光短暂保存；样品稀释倍数为6） 3.鸡蛋 （1）称取鸡蛋样品2.0 g ± 0.02 g于50 mL离心管中； （2）加入组织提取液18mL，漩涡5min，4,000 rpm室温离心10min； （3）取上清液1mL于10 mL离心管中，加入1ml pH调节液，5ml氯仿，漩涡混匀1min； （4）4,000 rpm室温离心5min； （5）取下层氯仿于另一10ml离心管，40 ℃ ± 5 ℃水浴，氮气吹干； （6）加入2ml正己烷，样品稀释液2mL，漩涡1min； （7）4,000 rpm室温离心1min； （8）吸尽上层正己烷层和中间浑浊层，取下层澄清水相300μL于EP管中，取50ul检测。 （样品可4℃避光短暂保存，样品稀释倍数为20） 【测定程序】 1.取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条插入微孔架； 2.加标准液或样品液50 µL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置； 3.加抗体液50 µL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min； 4.甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30s左右，甩净PBST，在吸水纸上拍干。重复洗涤3~5次。 5.加酶标抗体液100µL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min； 6.甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取PBST 250μL于各孔，静置30s左右，甩净PBST，在吸水纸上拍干。重复洗涤3~5次。 7.加底物液100 µL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min； 8.加终止液50 µL至各孔；充分混合；30 min内在450 nm处测量吸光值。 【结果判定】 将标准液或样品液吸光值的平均值除以0标准孔的吸光值再乘以100 %，即为抑制率。在2.5~ 40 ppb范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。将样品的抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中泰乐菌素的实际浓度。 百分比吸光值（%）= 标准品（样品）吸光值 × 100% 0标准品（样品）吸光值 【注意事项】 1.使用之前将所有试剂平衡至室温20-25℃。 2.不要使用过了有效日期的试剂盒。不要交换使用不同批号的盒中试剂。 3.加样时请务必保持完全相同的加样方式并将加样时间控制在15min内。 4.测定过程中不要让微孔干燥，洗板拍干后应立即进行下一步操作，每加一种试剂前需将其摇匀。 5.底物液对光敏感，在配制和孵育显色时要避免强光直射。若出现变色现象应弃用。 6.测定时，若0标准孔OD值低于0.7（A450nm＜0.7）则提示试剂可能变质失效。 7.终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 8.检测完毕，所有试剂请立即密封后放回2-8℃，勿冷冻。 9.组织提取过程所有有机试剂均有一定毒性，为保证操作人员**，尽可能在通风厨内操作。 【储藏条件及保质期】 1.储藏条件：本试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。 2.保质期：本产品有效期为6个月，生产日期见包装盒