夏天无高效液相色谱指纹图谱研究

夏天无高效液相色谱指纹图谱研究
夏天无高效液相色谱指纹图谱研究

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     【摘要】目的研究夏天无药材的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，为科学评价及有效控制其质量提供实践方法和参考数据。方法采用HypersilBDSC18柱，(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈-水(30∶70,每100ml中加入pH6.0醋酸/醋酸铵缓冲液3ml)梯度洗脱,流速1.0min·min-1；在281nm波长下检测，测定10批次同一产地夏天无药材，并运用计算机辅助相似性评价系统计算图谱之间的相似度。结果10批夏天无药材指纹图谱之间的相似度很高。结论该方法重现性好，具有一定的专属性，可作为夏天无药材鉴别的依据。
　　
　　【关键词】夏天无高效液相色谱相似度指纹图谱
　　
　　Abstract:ObjectiveToestablishHPLCfingerprintofRhizomaCorydalisdecumbentis.MethodsHPLCwithHypersilBDScolumnwasusedwithmixtureofacetonitrileandwaterasmobilephaseinagradientelution.Theflowratewas1.0ml·min-1.Thedetectionwavelengthwasat281nm.TenbatchesofRhizomaCorydalisDecumbentisfromthesameproducingareaswereanalyzedtoestablishafingerprint.Thesimilarityinfingerprintwascalculatedbycomputer-aidedsimilarityappraisingsystem.ResultsAllofthe10batchesofsamplesshareahighsimilarity.ConclusionThemethodisreproducibleandexclusive.ItmayprovidethebasisforidentifyingXiatianwu.
　　
　　Keywords:RhizomaCorydalisdecumbentis;HPLC;Similarity;Fingerprint
　　
　　夏天无(Xiatianwu,RhizomaCorydalisDecumbentis)为罂粟科植物伏生紫堇Corydailsdecumbens(Thunb.)Pers.的干燥块茎，用于**高血压、风湿性关节炎、坐骨神**等病［1］，疗效显著。《中国药典》2000年版Ⅰ部中以夏天无的单一成分原**碱为质量控制指标。但**碱并不是夏天无的特有成分，它存在于罂粟科的多种植物中，单一原**碱的定性与定量并不能确切地反应夏天无药材的质量。因此我们对夏天无进行指纹图谱研究，建立一种能够比较**地反应其质量，并能对其质量进行控制的行之有效的方法。
　　
　　1仪器与药品
　　
　　1.1仪器
　　
　　METTLERAE240型十万分之**平(瑞士)；KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；P200Ⅱ高效液相色谱仪、UV200Ⅱ紫外检测器(大连依利特分析仪器有限公司)；KromasilC18柱(安吉伦公司)。
　　
　　1.2药品
　　
　　夏天无药材(由江西天狮集团提供，江西中医学院中药鉴定教研室鉴定为**，)；延胡索乙素对照品(中国药品生物制品检定所，批号0726-200107)；原**碱对照品(由江西省药检所提供)；延胡索药材(购自南昌市黄庆仁青山路分店，江西中医学院中药鉴定教研室鉴定为**)；甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
　　
　　2方法与结果
　　
　　2.1HPLC色谱条件的选择色谱条件为：用十八烷基键合硅胶为填充剂(HypersilBDSC18柱，250mm×4.6mm，5μm)；乙腈-水(30∶70，每100ml中加入pH6.0醋酸/醋酸铵缓冲液3ml)；检测波长281nm；流速1.0ml·min-1；柱温30℃；进样量5μl。
　　
　　2.1.1流动相的选择条件
　　
　　分别比较了甲醇-水-10%醋酸系统，甲醇-醋酸钠-冰醋酸系统，甲醇-水系统，乙腈-水系统，并采用单纯格子设计法进行优化实验。结果乙腈-水(缓冲盐)30∶70系统分离度好，故选择其作为流动相。
　　
　　2.1.2检测波长的选择在实验过程**选择了220，254，281nm3种波长做为考察。在此3个波长下的HPLC图谱中均有相同数目的色谱峰。但是281nm波长下，峰强度*大，因此选定281nm作为检测波长。
　　
　　2.2供试品溶液提取方法的考察比较了超声处理器和索氏提取器的提取效果，结果见图1～3及表1。
　　
　　从图1～3及表1可以看出，索氏提取的HPLC图更符合指纹图谱的要求，因此样品的处理选用索氏提取加热回流4h。表1提取效率比较(略)
　　
　　2.2.1供试品溶液的制备
　　
　　取夏天无细粉0.5g，精密称定，加硅藻土1g拌匀，置索氏提取器中，加浓氨试液1ml，氯仿120ml，水浴回流提取4h，提取液浓缩至近干，残渣用适量甲醇使溶解转移置10ml容量瓶中，稀释，摇匀，即得。
　　
　　2.2.2对照品溶液的制备取延胡索乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含0.08mg的溶液，即得延胡索乙素对照品溶液；另取原**碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含0.08mg的溶液，即得原**碱对照品溶液。
　　
　　2.2.3测定方法
　　
　　精密吸取供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录1h的色谱图。
　　
　　2.3指纹图谱的方法学考察
　　
　　2.3.1精密度实验精密吸取同一供试品溶液5ml，注入色谱仪，重复进样5次。可定量的色谱峰有12个，其中的10个色谱峰重现性好，其相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%，10个峰占总峰面积的90%以上，表明仪器精密度良好。
　　
　　2.3.2稳定性实验取同一供试品溶液,分别在0，12，24，36，48h测定，结果各峰相对峰面积的RSD小于5%，相对保留时间的RSD小于5%，表明供试品溶液在48h内基本稳定。
　　
　　2.3.3重复性实验取同一批供试品溶液5份，照“色谱条件与系统适用性实验”项下操作，结果其相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%。
　　
　　2.4夏天无药材指纹图谱的测定取10批夏天无药材，精密称定，制备供试品溶液，照“色谱条件与系统适用性实验”项下操作，记录1h色谱图，10批次药材图谱及数据见表2。表210批夏天无指纹图谱数据(略)
　　
　　2.4.1共有峰的标定根据10批夏天无药材的指纹图谱，分别提取其共有的且峰的面积相对稳定，其峰面积之和占总面积90%以上的峰作为共有峰，并参照精密度的有关数据，确定夏天无的共有峰为10个。
　　
　　相对保留时间/min：
　　
　　0.848 0.012(1)0.931 0.007(2)1.000(S1)1.122 0.007(3)1.260 0.01(4)1.587 0.013(5)1.965 0.009(S2)4.415 0.006(6)4.701 0.024(7)5.056 0.023(8)。
　　
　　特征指纹峰面积对比值：
　　
　　0.478 7%(1)0.058 10%(2)1.000(S1)0.151 10%(3)1.093 15%(4)0.484 4%(5)0.374 10%(S2)1.953 30%(6)0.446 9%(7)1.791 30%(8)。
　　
　　2.4.2指纹图谱相似度的判定文章使用计算机辅助相似性评价系统，夏天无指纹图谱的相似度结果如图4。
　　
　　3讨论
　　
　　固定相选择了3种不同填料的柱子HypersilODS2，HypersilBDS，KromasilODS；其中HypersilODS2不适用于碱性化合物的分析,而KromasilODS柱和HypersilBDS柱对碱性化合物有更好的峰型和稳定性且两者的HPLC色谱图基本一致,在夏天无生物碱分析中可通用。
　　
　　采用索氏提取器对氯仿和乙醚两种溶媒的提取效果进行比较，对于*先出峰的极性生物碱，以乙醚未能完全分离，而氯仿的提取物可以分离，因此选择氯仿为提取溶媒。
　　
　　本指纹图谱中存在一个三连驼峰,曾试过多种条件分离均未获成功，在本实验条件下,该峰形稳定性、重现性较好,可作为夏天无指纹图谱的特征峰,用以和其它同科药材的鉴别。
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