小叶丁香不同部位橄榄苦苷含量的高效液相色谱法测定

小叶丁香不同部位橄榄苦苷含量的高效液相色谱法测定
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     【摘要】目的建立新药材小叶丁香橄榄苦苷的含量测定方法，研究小叶丁香药材花、茎、叶中橄榄苦苷的含量。方���采用KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，柱温25℃；流动相为乙腈-水(25∶75)，流速1.0ml·min-1；检测波长285nm。结果橄榄苦苷的线性范围是0.005～0.075mg/ml，r=0.9998；平均回收率为100.41%，RSD为1.46%，稳定性实验RSD为0.56%(n=6)。花、茎、叶不同部位药材中橄榄苦苷的含量分别为：1.37%，0.87%，1.03%。结论该方法快速简便，准确性重复性好，不同部位橄榄苦苷含量差异较大，为橄榄苦苷的提取和利用提供可靠的数据。
　　
　　【关键词】小叶丁香；橄榄苦苷；高效液相色谱
　　
　　小叶丁香SyringapubesceusTurcz是木樨科(Oleaceae)丁香属(Syringa)植物，产于河南、河北、陕西等地［1］。经近几年的研究发现，小叶丁香的醇提取物具有抗肝纤维化的作用，其有效成分为以橄榄苦苷为代表的裂环环烯醚萜苷类化合物［2～6］。橄榄苦苷是一种重要的裂环环烯醚萜苷类化合物，广泛存在于木犀科的木犀榄属、丁香属、女贞属、木犀属和**属植物中，到目前为止已提取分离出橄榄苦苷的木犀科植物至少在25种以上。研究表明橄榄苦苷具有抗**、**、抗病毒、预防冠心病、动脉粥样硬化、舒缓血管平滑肌、抗氧化、**和降血糖等多种药理作用。目前橄榄苦苷的测定方法主要有紫外色谱法和高效液相色谱法，其中以高效液相色谱法分析更加准确、快速、简便。运用高效液相色谱法比较测定药材小叶丁香中各个部位橄榄苦苷的含量的研究尚未有文献报道。本实验采用高效液相色谱法建立一种小叶丁香中橄榄苦苷定量测定方法，并比较不同部位橄榄苦苷的含量。
　　
　　1仪器与材料
　　
　　1.1仪器高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器，EmpowerProject色谱工作站(Waters公司，美国)；BP210S电子分析天平(赛多利斯有限公司，德国)；LXJ-II离心沉淀机(上海医用分析仪器厂，上海)；ZFQ85A旋转蒸发器(上海医械专机厂，上海)。
　　
　　1.2材料与试剂小叶丁香药材采自河南省洛阳市嵩县，经河南农业大学朱长山教授鉴定，样品保存在河南科技大学天然产物研究室。对照品橄榄苦苷由本研究室自制，经核磁共振和高效液相色谱测定，纯度大于98%。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，用时均用0.45μm的微孔膜过滤，其他试剂均为分析纯。
　　
　　2方法与结果
　　
　　2.1吸收波长的选择精密称取橄榄苦苷10.0mg，用乙腈定容于50ml容量瓶中，稀释10倍后用可见紫外分光光度计进行全波长扫描，用乙腈作空白，在波长200～400nm间扫描，可以看出橄榄苦苷在285nm处有明显的吸收峰。
　　
　　2.2色谱条件Waters600高效液相色谱仪；色谱柱为KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-水(25∶75)；体积流量为1.0ml/min；检测波长285nm；柱温25℃；灵敏度0.5AUFS；进样量20μl。按照外标法测定，色谱图见图2。
　　
　　2.3对照品溶液的制备精密称取橄榄苦苷15.0mg，以乙腈为溶剂定容于100ml容量瓶中，加乙腈使其溶解并稀释至刻度，摇匀，即得橄榄苦苷对照品的母液，浓度为0.150mg·ml-1。精密吸取母液2ml于10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，即为对照品溶液。
　　
　　2.4溶液样品的制备准确称取阴干粉碎后的小叶丁香花、茎和叶粉末各10g，加入90%乙醇300ml，加热回流提取3h，冷却后过滤，共提取3次，合并滤液，减压浓缩至干，残渣用乙腈溶解并转移定容至500ml容量瓶中，摇匀。准确吸取2ml，置于10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，超声，用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
　　
　　2.5标准曲线的绘制精密吸取0.150mg·ml-1的橄榄苦苷标准液1，2，3，4，5ml置10ml容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。按照上面的色谱条件分别进样20μl进行分析，测定峰面积。以对照品的峰面积(Y)为纵坐标，进样浓度为横坐标(X)作图，得线性回归方程Y=47058X-60175，r=0.9998，表明橄榄苦苷的线性范围是0.005～0.075mg/ml。
　　
　　2.6精密度实验按上述色谱条件，用浓度为0.03mg/ml的对照品标准液进样5次，每次20μl，分别测得记录峰面积，结果测得峰面积的RSD为0.96%。
　　
　　2.7稳定性实验取同一供试品溶液20μl于0，2，4，6，8，24h进样，记录峰面积，供试品溶液在24h内稳定性良好，橄榄苦苷峰面积RSD为0.56%，结果表明，样品溶液在12h内稳定。
　　
　　2.8重复性实验取小叶丁香花、茎和叶粉末各6份，按照“2.4”项制备样品的方法制备样品溶液，再按照上述色谱条件进行分析，结果表明重复性良好，花中橄榄苦苷的平均含量为1.05%，RSD为1.0；茎中橄榄苦苷的平均含量为0.84%，RSD为1.3%；叶中橄榄苦苷的平均含量为1.40%，RSD为0.8。
　　
　　2.9回收率实验取5.0g小叶丁香花、茎和叶粉末各6份，按照上述制备母样品溶液的方法制备样品溶液各6份，分别准确加入0.02，0.04，0.06mg·ml-1橄榄苦苷对照品各10ml，进行3组平行实验，每组2份，按照上述色谱条件进行分析，结果表明回收率良好，平均回收率为100.41%，RSD为1.46%。
　　
　　2.10样品的测定取小叶丁香不同部位的粉末按“2.4”项中方法制备样品溶液6份，按照上述色谱条件进行分析，测定橄榄苦苷的含量。结果表明花中橄榄苦苷的平均含量为1.37%，RSD为1.2%；茎中橄榄苦苷的平均含量为0.87%，RSD为1.1%；叶中橄榄苦苷的平均含量为1.03%，RSD为1.5%。
　　
　　3讨论
　　
　　本文采用HPLC法测定小叶丁香中橄榄苦苷的含量，方法准确、灵敏、快速，为小叶丁香中橄榄苦苷的研究开发提供科学合理的检测方法和检测指标。
　　
　　实验结果表明，采自伏牛山区嵩县车村镇的小叶丁香，不同部位橄榄苦苷的含量具有明显的差别，其中花中橄榄苦苷的含量*高，茎中含量相对较低。研究为小叶丁香中橄榄苦苷的提取纯化和该药材的进一步研究开发利用提供了依据。
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