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动物**管内皮细胞的分离

基本方案1：

灌注消化法

实验材料：

1. 哺乳动物胸导管**管

2. 1×PBS，含青霉素100u/ml和链霉素100μg/ml，pH7.4

3. 0.2%Ⅰ型胶原酶

4. 眼科剪，眼科镊

5. 慕丝线（7号线）、细铁丝

6. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 处死动物后，打开胸腔，分离胸导管，在胸导管上端结扎，切取10-15cm的一段。将胸导管放入预冷PBS中漂洗。

2. 在解剖显微镜下，用眼科剪和眼科镊剥除外膜的脂肪和纤维组织，然后用PBS反复冲洗管腔。

3. 将胸导管移入含PBS的大培养皿中，清洗3次。在胸导管的远端插入静脉留置针，并结扎固定。用PBS冲洗管腔后，将游离端结扎。用静脉留置针向管腔内注入消化液，至**管充盈为止。在37℃条件下，消化10min。**管的管壁较薄，灌注消化时间不宜过长，以免消化过度，引起成纤维细胞的污染。

4. 取出胸导管，在游离端剪一小口，用离心管收集消化液，然后用培养液冲洗管腔，收集消化液和冲洗液，以1000r/min，离心10min。离心后吸去上清液，用培养液轻轻混悬细胞。

5. 将细胞接种于培养皿或培养板中，培养24h后补充培养液，继续培养。每隔2-3d换液1次。换液时，吸去1/2-2/3培养液，再加入新鲜培养液。

6. 原代培养4-6h后，大部分细胞已贴壁生长。24h后，内皮细胞形成由数个细胞组成的细胞群。**管内皮细胞的活性较低，原代培养时细胞生长缓慢。2-3周后，细胞生长形成单层。**管内皮单层呈卵石状特征性排列，可传代培养。

7. PriCells-原代内皮细胞特制基础培养基

8. PriCells-原代内皮细胞培养特制添加剂

9. PriCells-原代细胞分离试剂盒

10. PriCells-原代细胞鉴定试剂盒

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