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DNA重组实验方法

实验原理
DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
仪器、材料与试剂
一、仪器
1．恒温摇床
2．恒温水浴
3．恒温培养箱
4．小型高速离心机
二、材料
1．氨苄青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA连接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 质粒
6．培养皿
7．接种针
8．金属涂棒
9． 1.5mL 离心管
10．酒精灯
11．镊子、灭菌牙签等
三、试剂
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒
实验步骤
一、质粒DNA
提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。
二、制备重组DNA
1. 在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL（2mg／mL），2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。
2. 在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18-CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。
3. 反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。
4. 将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。
5. 将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：
在10mL DNA样品中，加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。
三、转化感受态细胞
1. 制备的感受态细胞（-20℃保存的）。
2. 在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。
实验结果
过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。

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