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胆碱酯酶抑制法测定有机磷农药残留量

胆碱酯酶抑制法测定有机磷农药残留量

(本法参照GB/T 5009·199-2003)

一、原理

有机磷类(OPS)和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶(AchE)的活性具有很强的抑制作用。向样品中添加一定量的乙酰(或丁酰)胆碱酯酶，如果样品中含有上述两大类农药，即会对酶的活性产生抑制作用。当向含有农药的样品中添加底物(碘化硫代乙酰胆碱)和显色剂(二硫代二硝基苯甲酸)时，酶由于丧失活性而不能催化底物分解并完成显色反应；相反，如果样品中不含农药，胆碱酯酶则能催化底物分解并完成显色反应。通过分光光度计于412nm波长下比色，能测出颜色变化造成的吸光度之差，再通过吸光度的变化计算出酶的抑制率。酶的抑制率越大，说明样品中残留农药的含量越高。

二、试剂

1、磷酸盐缓冲溶液：3.2gKH₂PO₄和11.9gK₂HPO₄配成1000mL，PH8.0。

2、显色剂：160mg二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg碳酸钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。

3、底物：取25.0mg碘化硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶解，摇匀后4℃冰箱中保存备用，保存期不超过2周。

4、胆碱酯酶溶液：称取0.040g丁酰胆碱酯酶(粉剂)或乙酰胆碱酯酶，加入2mL磷酸盐缓冲溶液，溶解后低温保存，1周内可用。

三、仪器

1、农药残留快速测定仪或分光光度计。

2、分析天平。

3、恒温烘箱。

四、测定步骤

1、取蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm见方的碎片，取样1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL缓冲液振荡1～2min，倒出提取液，静置3～5min备用。

2、对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲液，再加入0.1mL胆碱酯酶溶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15min以上(每批样品测试时放置时间应一致)。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色，应立即用1cm比色皿放入农药残留快速测定仪(或分光光度计)，记录反应3min的吸光度变化值△A₀。

3、样品溶液测定：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值△A_t。

五、结果计算与判定

抑制率(%)=[(△A₀-△A_t)/ △A₀]×100

式中：

△A₀-对照溶液反应3min吸光度变化值；

△A_t -样品溶液反应3min吸光度变化值。

当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。

本检验方法阳性结果符合率在80%以上。

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