土壤硝态氮的测定
4.4.2.1酚二磺酸比色法
4.4.2.1.1方法原理 土壤浸提液中的NO3－—N在蒸干无水怕条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。
C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O
2，4-酚二磺酸 6-硝基酚-2，4-二磺酸
此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mol·L-1 NO3－—N，测定范围为0.1～2mol·L-1。
4.4.2.1.2主要仪器 分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。
4.4.2.1.3试剂 CaSO4·2H2O（分析纯、粉状）、CaCO3（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）、MgCO3（分析纯、粉状）、Ag2SO4（分析纯、粉状）、1:1 NH4OH、活性碳（不含NO3－）。
（1）酚二磺酸试剂：称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL纯浓H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。使用时须注意其强烈的腐蚀性。如无发烟H2SO4，可用酚25.0g，加浓H2SO4225mL，沸水加热6h配面。试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。
（2）10µg·mL-1 NO3－—N标准溶液：准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100µg·mL-1 NO3－—N溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg·mL-1 NO3－—N标准溶液。
4.4.2.1.4操作步骤
（1）浸提 称取新鲜土样（注1）50g放在500mL三角瓶中，加入CaSO4·2H2O0.5g（注2）和250mL水，盖塞后，用振荡机振荡10min。放置5 min后，将悬液的上部清液用干滤纸过滤，澄清的滤液收集地干燥洁净的三角瓶中。如果滤液因有机质而呈现颜色，可加活性碳除之（注3、4）。
（2）测定 吸取清液 25～50mL（含NO3－—N20～150µg）于瓷蒸发皿中，加CaCO3约0.05g（注5），在水浴上蒸干（注6），到达干燥时不应继续加热。冷却，迅速加入酚二磺酸试剂2 mL，将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物。静止10min使其充分作用后，加水20 mL，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1 NH4OH（注7）并不断搅混匀，至溶液呈微碱性（溶液显黄色）再多加2mL，以保证NH4OH试剂过量。然后奖溶液全部转入100mL容量瓶中，加水定容（注8）。在分光光度计上用光径1cm比色杯在波长420nm处比色，以空白溶液作参比，调节仪器零点。
（3）NO3－—N工作曲线绘制：分别取10µg·mL-1NO3－—N标准液0、1、2、5、10、15、20mL于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与待测液相同操作，进行显色和比色，绘制成标准曲线，或用计算器求出回归方程。
4.4.2.1.5结果计算
土壤中NO3－—N含量（mg·kg-1）=
式中：ρ(NO3－—N)——从标准曲线上查得（或回归所求）的显色液NO3－—N质量浓度（µg·mL-1）；
V——显色液的体积（mL）；
ts——分取倍数；
m——烘干样品质量，g。
注释
注1．硝酸根为阴离子，不为土壤胶体吸附，且易溶于水，很易在土壤内部移动，在土壤剖面上下层移动频繁，因此测定硝态氮时注采样深度。即不仅要采集表层土壤，而且要采集心土和底土，采样深度可达40cm、60 cm以至120 cm。试验证明，旱地土壤上分析全剖面的硝态氮含量能更好地反映土壤人供氮水平。和表层土壤比较，则全剖面的硝态氮含量与生物反应之间有更好的相关性，土壤经风或烘干易引起NO3－—N变化，故一般都用新鲜土样测定。
注2．用酚二磺酸法测定硝态氮，首先要求浸提液清彻，不能混浊，但是一般中性或碱性土壤滤液不易澄清，且带有机质的颜色，为此在浸提液中应加入凝聚剂。凝聚剂的种类很多，有CaO、Ca(OH)2、CaCO3、MgCO3、KAl(SO4)2、CuSO4、CaSO4等，其中CuSO4有防止生物转化的作用，但在过滤前必须以氢氧化钙或碳酸镁除去多余的铜，因此以CaSO4法提取较为方便。
注3．如果土壤浸提液由于有机质而有较深的颜色，则可用活性炭除去，但不宜用H2O2，以防*后显色时反常。
注4．土壤中的亚硝酸根和氯离子是本法的主要干扰离子。亚硝酸和酚二磺酸产生同样的黄色化合物，但一般土壤中亚硝酸含量极少，可忽略不计。必要时可加少量尿素、硫尿和氨基磺酸（20g·L-1NH2SO3H）以除去之。例如亚硝酸根如果超出了1µg·mL-1时，一般每10mL待测液中加入20mg尿素，并放置过夜，以破坏亚硝酸根。
检查亚硝酸根的方法：可取待测液5滴于白瓷板上，加入亚硝酸试粉0.1g，用玻璃棒搅拌后，放置10min，如有红色出现，即有1mg·L-1亚硝酸根存在。如果红色极浅或无色，则可省去破坏亚硝酸根手续。
NO3-+3Cl-+4H+→NOCl+Cl2+2H2O
亚硝酰氯
Cl-对反应的干扰，主要是加酸后生成亚硝酰氯化合物或其它氯的气体。如果土壤中含氯化合物超过15mg·kg-1，则必须加Ag2SO4除去，方法是每100mL浸出液中加入Ag2SO40.1g(0.1g Ag2SO4可沉淀22.72mg Cl-)，摇动15min，然后加入Ca(OH)20.2g及MgCO30.5g，以沉过量的银，摇动5min后过滤，继续按蒸干显色步骤进行。
注5．在蒸干过程中加入碳酸钙是为了防止硝态氮的损失。因为在酸性和中性条件下东干易导致硝酸离子的分解，如果浸出液中含铵盐较多，更易产生负误差。
注6．此反应必须在无水条件下才能完成，因此反应前必须蒸干。
注7．碱化时应用NH4OH，而不用NaOH或KOH，是因为NH3能与Ag+络合成水溶性的[ (NH3)2]+，不致生成Ag2O的黑色沉淀而影响比色。
注8．在蒸干前，显色和转入容量瓶时应防止损失。
4.4.2.2还原蒸馏法
4.4.2.2.1方法原理 土壤浸出液中的NO3-和NO2-在氧化镁存在下，用FeSO4-Zn还原蒸出氨气为硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定。单测硝态氮时，土壤用饱和硫酸钙溶液浸提，联合测定铵态氮和硝态氮时，土壤用氯化钾浸提。
4.4.2.2.2试剂
（1）饱和硫酸钙溶液 将硫酸钙加入水中充分振荡，使其达到饱，澄清。
（2）0.01mol·L-1HCl标准溶液 将浓盐酸(HCl，ρ≈1.19g·mL-1,分析纯)约1mL稀释至1L，用硼砂标准液标定其准确浓度。
（3）甲基红—溴甲酚绿混合指示剂 称取甲基红0.1g和溴甲酚绿0.5g于玛瑙研钵中，加入100mL乙醇研磨至完全溶解。
（4）氧化镁悬液 称取氧化镁（MgO，化学纯）12g，放入100mL水中，摇匀。
（5）硫酸亚铁锌还原剂 称取锌粉（Zn，化学纯）与亚铁硫酸（FeSO4·7H2O，化学纯）按1：5混合，磨细。
（6）硼酸指示剂溶液 称取硼酸20g溶于水中，稀释至1L，加入甲基红—溴甲酚绿指示剂20mL，并用稀碱或稀酸调节溶液为紫红色（约pH4.5）。
4.4.2.2.3主要仪器 往复式振荡机和定氮蒸馏装置。
4.4.2.2.4操作步骤
（1）浸提。见4.1.3.1.1.4(1)
（2）蒸馏 吸取滤液25mL,放入定氮蒸馏器中，加入氧化镁悬液10mL，通入蒸汽蒸馏去除铵态氮，待铵态氮去除后（用钠氏试剂检查），加入硫酸亚铁锌还原剂约1g，或节瓦尔德合金（过60号筛）0.2g，继续蒸馏，在冷凝管下端用硼酸溶液吸收还原蒸出的氨。用盐酸标准溶液滴定。同和空白试验。
4.4.2.2.5结果计算
土壤硝态氮NO3－—（N）含量（mg·kg-1）=
式中：c——盐酸标准溶液浓度（mol·L-1）；
V——样品滴定HCl标准溶液体积(mL)；
V0——空白滴定HCl标准溶液体积(mL)；
14.0——氮的原子摩尔质量（g·mol-1）；
ts——分取倍数；
103——“换算系数”（包括mL换算为L，10-3；g换算为mg，103；换算为kg，103）；
m——烘干样品质量（g）。
