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(PCR扩增仪)PCR扩增的基本方法反应成分和作用
(
PCR
扩增仪)
PCR
扩增的基本方法反应成分和作用
PCR
反应的成分和作用
总体积:一般为25μl~100μl
一、无Mg2+buffer:由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值,使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度,但不能超过50?mmol/L,否则会抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:终浓度为1.5~2.0mmol/L,其对应dNTP为200?μmol/L,注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系,由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+,当dNTP浓度达到1?mmol/L时会抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影响反应的特异性和产率。、
三、BSA:一般用乙酰化的BSA,起着减少
PCR
管
对Taq酶的吸附作用,对Taq酶有保护作用。
四、底物(dNTPs):dNTPs具有较强酸性,其储存液用NaOH调pH值至7.0~7.5,一般存储浓度为 10 mmol/L,各成份以等当量配制,反应终浓度为20~200μmol/L。高浓度可加速反应,但同时增加错误掺入和实验成本;低浓度可提高**性,而反应速度会降低。
五、Taq酶:能耐95℃高温而不失活,其*适pH值为8.3~8.5,*适温度为75~80℃,一般用72℃。能催化以DNA单链为模板,以碱基互补原则为基础,按5’→3’方向逐个将
dNTP
分子连接到引物的
3
’端,合成一条与模板
DNA
互补的新的
DNA
子链。无
3
’→
5
’的外切酶活性,没有校正功能。某种
dNTP
或
Mg2+
浓度过高
,
会增加其错配率。用量一般为
0.5
~
5
个单位
/100
μ
l
。
六、模板:PCR对模板DNA的纯度不要求很高,但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高,否则扩增可能不会成功,在此情况下可适当稀释模板。
七、引物:引物浓度一般为0.1~0.5μmol/L,浓度过高会引起错配和非特异扩增,浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15~30个碱基,引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对,末位碱基*好选用A、C、G(因T错配也能引发链的延伸)。
引物G+C约占45~55%,碱基应尽量随机分布,避免嘧啶或嘌呤堆积,两引物之间不应有互补链存在,不能与非目的扩增区有同源性。
上海领成生物科技有限公司
,
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主要生产销售领成tocan牌凝胶成像,雪花制冰机,pcr仪,离心机,显微摄影,紫外分析仪等自主产品,其中凝胶成像,雪花制冰机,pcr仪,离心机,紫外分析仪,在国内已负盛名,如需了解公司产品,欢迎拨打咨询专线,价格合理,质量保证
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