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梯度PCR梯度设置技巧(退火温度的探索)
梯度
PCR
梯度设置技巧(退火温度的探索)
相信在
PCR
时大家遇到*为关键的问题就是关于
退火温度
的探索。下面我们就来谈谈这方面的内容。
1.
公式计算
退火温度=
Tm
-(
5
℃
~
8
℃
);
Tm
=
4×
(
G
+
C
)+
2×
(
A
+
T
)。首先用
公式计算出引物
Tm
值,退火温度粗略的比引物的
Tm
低
5
℃
左右,此法所得结果较为粗略
2.
软件计算
将设计的引物和
PCR
产物放到
Oligo 6
或
Primer5
中去评价,软件分析得出*佳的退火温度和循环参数。此法所得结果较为接近实际退火温度。
3.
用梯度
PCR
仪
探索
退火温度
下面我们以
12x8
的
96
孔
梯度
PCR
仪
来为例说明。首先设定温度梯度,例如设定初始温度为
58
℃
,温度梯度是
12
,那么每一排的温度差就是
12/12
(可设
12
个温度梯度的梯度
PCR
仪,每一排即每
8
个孔温度相同)。然后,
PCR
结束后点样观测哪个温度的样品条带*好,进而确定该引物的退火温度。
用梯度
PCR
仪寻找*佳
PCR
退火温度方便简单,能够减少寻找*佳退火时所需
PCR
循环的次数和时间。
4.
关于引物产品
说明书
标明的退火温度
一般情况下合理的退火温度约是从
55
℃
到
70
℃
。退火温度的设定一般要比引物的
Tm
低
5
℃
。实验过程中设置退火温度时应比
引物产品说明书标明的退火温度高出
1
℃
~2
℃
*佳。
以上就是常见关于退火温度的探索,仅供参考。实际操作中只要大家多多操作,认真探索,解决这个问题并不困难。
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