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白细胞分离:(加速红细胞沉降法)
加速红细胞沉降法 利用高分子量的聚合物促使红细胞凝聚成串钱状,从而加速红细胞沉降,使
之与白细胞分离。
常用的高分子聚合物有明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及甲基纤维素等。
(1) 试剂及配制
3%明胶(灏洋生物产)(粘度为25泊以上):选取上等明胶,用生理盐水配成3%溶液,置沸水
浴加热溶解,分装,高压蒸汽灭
菌8磅15-20min.
6%右旋糖酐(灏洋生物产)(分子量200-400KD):用生理盐水配制。
操作方法分为2种。
**种:①取抗凝静脉血加入等量3%明胶盐水溶液中,混匀或用3份血液与1份3%明胶溶液混
匀;②将试管直
立静置室温或37℃温箱中30-60min,利用明胶与红细胞的粘合作用,促使红细胞快速下沉,而白
细胞留在明胶溶液
中;③用毛细吸管吸取富含白细胞的上层液,移入另一试管中;④按自然沉降法④-⑤操作。
**种:①取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血,混匀;②按操作方法1的②-④操作。
外周血单个核细胞分离试剂:(聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法)
外周血中单个核细胞(PBMC)包括**细胞和单核细胞,其体积、形状和比重与其他细胞不同,
红细胞和多核
细胞比重较大,为1.092左右,而**细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重1.077左右的分
层液作密度梯度
离心,使一定比重的细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。
1.试剂及配制
⑴聚蔗糖泛影葡胺分层液(LTS1077):(灏洋生物有成品供应),比重为1.077±0.001
⑵台盼蓝染液:称取4g台盼蓝,于研钵中用少量双蒸水研磨,加双蒸水至100ml ,1500r/min离心
15min,吸出上层液,
即为4%水溶液。用前,1.8%氯化钠溶液1倍,即为2%台盼蓝染液。
2.操作方法
⑴取静脉血放入抗凝管,摇允,用Ph7.2-7.6 Hank 液稀释血液1-2倍。
⑵取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分层液(灏洋生物产)3-4ml,放入15X150mm试管中。
⑶用毛吸管吸取稀释血液,在离分层液上1cm处,沿试管壁徐徐加入,使稀释血液重叠于分层液
上,稀释血液与
分层液体积比例约为2:1。
⑷用水平离心机以2000r/min离心30min,离心后管内容物分为三层,上层为血浆(内含血小板),
中间层为分层液,
底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层。
⑸用毛细吸管轻轻插到白膜层,沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞,移入另一试管中。
⑹加5倍以上体积不含Ca2+、Mg2+Hank液,混匀,1500r/min离心10min,吸弃上清,重复洗涤2次。
⑺末次离心后,吸尽上清。按每毫升血液标本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混悬细胞。取1
滴细胞悬液置血
6
球计数板内计数。然后细胞浓度调节至2X10 /ml
⑻细胞活力检测:取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀,加盖片,显微镜高倍镜检。活细胞
不着色,折光强;
死细胞被染成蓝色,体积略膨大。活细胞数应在95%以上。
3.注意事项
⑴用稀释后的全血可是单个核细胞得率高,将稀释的血液叠加于分层液上时,一定要细心,动作
要轻,避免冲散
分层液面或与分层液混合而影响分离结果。
⑵配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗,具缓冲作用,并对细胞无毒性。
⑶吸取单个核细胞时,应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染。
⑷配制好的单个核细胞可放室温或0-4℃,后一条件较好,可减低细胞代谢活动。注意不要迅速
改变其所出的温
度,以免造成“温度”休克。
通用型细胞分离液(LTS1130) 的比重的配方(灏洋生物产)
取比重LTS1077的人**细胞分离液(灏洋生物产) 3ml ,放入15X150mm试管中。
用PBS将肝素抗凝血稀释1-2倍后,将稀释全血加到LTS1077分离液上,稀释的血液:分离液约为
2:1。
用水平离心机以1500r/min离心10min,离心后,单个核细胞位于血浆和分离液的界面层,红细胞和
粒细胞沉淀在
分离液层下,一部分单核细胞和血小板位于分离液层上。
吸取界面单个核细胞层,用PBS洗三次。
用适当的培养液重叠单个核细胞,配成所需浓度的细胞。
用台盼蓝拒染法检查细胞活力。
NK细胞分离试剂:细胞分离液不连续梯度分离法
通用型细胞(LTS1130)分离液,为无毒、无刺激的新型密度梯度离心分离剂。其在离
心过程中会自然
形成密度梯度,从而将不同密度的细胞分离出来
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