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考马斯亮蓝
考马斯亮蓝coomassie brilliant blue一定范围内与蛋白质浓度成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,*大光吸收在465nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有*大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
染色————————————————————————————————————
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
测定含量
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简介
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较**的,但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于细胞骨架的检验。
浓染液
将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇,加入100mL浓磷酸,然后,用蒸馏水补充至200mL,此染液放4℃至少6个月保持稳定。
样本准备
尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之间绘制标准曲线。
溶解
将待测样本溶于100~1缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(*好用PBS)。
稀释
按1:5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去。
作用
每个样本加5mL
稀释的染料结合溶液,作用5~30min。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。注意,显色反应不得超过30min.
计算
根据标准曲线计算待测样本的浓度。
处理方法
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考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
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