酚类化合物的去除

酚类化合物的去除 

 
经过Li+或Ca2+沉淀RNA的办法可以将未被氧气化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA接合的多酚，可以直接经过离心去洗雪，或在苯酚、氯仿抽提时去掉除掉。在利用高液体浓度的2-丁氧气酒精（50****）来沉淀RNA时，因为多酚溶解于2-丁氧气酒精中而被去掉除掉。而后用含50**** 2-丁氧气酒精的缓和冲突液荡涤RNA沉淀以去除**的多酚。因为这个纵然多酚被氧气化，其氧气化产物仍可以溶解在高液体浓度2-丁氧气酒精溶液中而被去除，无须再用NaBH4来处置。

多糖的干扰及对策

多糖的污染是提出取得植物RNA时不时碰到的另一个棘手的问题。植物团体中往往富含多糖，而多糖的很多理化性质与RNA很相仿，因为这个很难将他们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，导致RNA产量的减损；而在沉淀RNA时，也萌生多糖的凝胶状沉淀，这种包括多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后萌生粘稠状的溶液。因为多糖可以制约很多酶的活性，因为这个污染了多糖的RNA样品没有办法用于进一步的分子生物科学研讨。在常理的办法中，经过SDS-盐酸胍处置可以局部去除一点多糖；在高液体浓度Na+或K+离子存在条件下，经过苯酚、氯仿抽提可以去掉除掉一点多糖；经过LiCl沉淀RNA也可以将局部多糖留在上清液中。但纵然经过这些个步骤仍会发觉有相当多的多糖与RNA混合掺杂在一块儿，所以还需求用更管用的办法来解决植物RNA离合醇化时多糖污染的问题。

用低液体浓度酒精沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的办法。在RNA提出取得液或溶液中不迅速参加无薄酒精至终液体浓度10****-30****，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保存于溶液中。普通都是在植物材料的匀浆液中参加酒精，如在从被子植物的木质部中提出取得RNA时，在匀浆上清液中参加酒精至终液体浓度10****以沉淀多糖。但在从蒲桃浆果团体中提出取得RNA时，也可以在用CsCl超离心，酒精沉淀在这以后的RNA溶液中参加终液体浓度30****酒精来沉淀多糖的，进一步醇化了RNA样品。

另一个常用的办法是CH3COOH钾沉淀多糖法。有科学研究担任职务的人在提出取得云杉团体的RNA时在匀浆上清液中参加1/3大小的5MCH3COOH钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；一样也有科学研究担任职务的人在提出取得酸模植物花团体的RNA时参加的是1/5大小的5MCH3COOH钾（pH4.8）溶液。这个之外，在提出取得草棉叶和花粉的RNA时是加1/3大小的8.5MCH3COOH钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以去掉除掉多糖等杂质。也可以在提出取得某些植物材料的RNA时，是将上面所说的两种办法接合运用。如在提出取得杧果中果皮的RNA时，是在匀浆液中参加0.25大小的无薄酒精和0.11大小的5MCH3COOH钾溶液以去除多糖杂质。不过在去除褐藻的多糖时，单独运用酒精或CH3COOH钾都失效，只有两者接合运用效果最佳。

缓和冲突液中包括高液体浓度的NaCl有助于去除多糖。在提出取得松树RNA时，缓和冲突液中NaCl的液体浓度为2.0M和1.0M，经过氯仿抽提和酒精沉淀RNA将RNA与多糖离合。也可以将胡羅蔔胚珠等材料苯酚提出取得后的上清液稀释，调节Na+离子液体浓度至80mM，而后参加0.4大小的2-丁氧气酒精来沉淀去除多糖。

蛋白杂质的影响及对策

氨基酸是污染RNA样品的又一个关紧因素。因为RNase和多酚氧气化酶亦归属氨基酸，故而要取得完整的、高品质的RNA就务必管用地去除蛋白杂质。常理的办法是在冷冻的条件下研磨植物材料以制约RNase等的活性；提出取得缓和冲突液中包括氨基酸改变性别剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基**基溴化铵（CTAB）等，这么在匀浆时可以使氨基酸改变性别，凝集；有的办法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除氨基酸。

额外，也可以利用氨基酸与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不一样将他们离合。在70****高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于氨基酸的溶解度，故而将大多氨基酸沉淀下来。继续在离心头清液中参加两倍大小的无薄酒精，这时RNA能沉淀下来而能溶于70****高氯酸钠溶液中的**氨基酸还是留在上清液中。这么可以去掉除掉绝大多的氨基酸。

次级代谢产物的影响及对策

从植物团体中提出取得高品质RNA的另一个不容易解决的地方是很多高等植物团体特别是成熟团体能萌生某些水溶性的次级代谢产物，这些个次级代谢产物很容易与RNA接合并与RNA并肩被抽提出来而阻拦具备有生命的物质活性的RNA的离合。因不可以确认这些个次级产物具体是啥子事物，所以，到现在为止还没有啥子特别的办法来解决这个问题。可以综合挑选性沉淀法、氯化铯梯度离心法和RNA回借方法醇化了松树胚珠、成熟松树针叶等植物团体的RNA。

因为植物团体尤其是高等植物团体细胞里外组成成分的复杂多样性，要得植物团体RNA的提出取得相对于其他有生命的物质材料来说要艰难的多。实践中常常会发觉，纵然同一栽种物的不一样团体其RNA提出取得办**有非常大的不一样；包括某种干扰因素的不一样植物材料，其适合使用的RNA提出取得办法有可能不一样；纵然是同一栽种物同一种团体材料，但出处于不一样基因型植株，其RNA提出取得办法也有可能不同。所以，对于某一植物或其团体来说，其相应的RNA提出取得办法不可少通过摸索和实践能力稳固建立。

随着植物分子生物科学研讨领域的开拓，可以肯定地说，在作为其研讨基础的植物材料RNA提出取得过程中还会显露出来新的不容易解决的地方，但随着不停地考求和经验的积累，科学办公者们一定会速决这些个不容易解决的地方，为植物分子生物科学的进展铺平道路。