**代高通量**筛选平台更容易发现磷脂酰肌醇信号通路低亲合力抑制剂
EJ Dell1, JL Tardieu2, F. Degorce2, Michael Fejtl1
1 BMG LABTECH Inc. NC, USAedward.dell@bmglabtech.com
2 Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France
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关键词:高通量,**筛选,HTS,HTRF,Cisbio,BMG Labtech,PHERAstar FS,磷脂酰肌醇信号通路,低亲合力,抑制剂,G-蛋白偶联受体,GPCRs
摘要:
通过传统的高通量**筛选平台(HTS)所发现的可市场化的**不仅数量少,而且市面上大部分的**都是小分子量(<500Da)物质。这似乎说明,运行于更低体积和更低浓度下的传统高通量**筛选平台,错失了发现更低亲合力**的机会。
市场的需求催生了下一代高通量**筛选平台——来自德国BMG LABTECH公司的PHERAstar FS,以光电倍增管(PMT)检测技术为核心的多功能微孔板检测仪。与来自另一品牌在行业中处于领导地位的以CCD相机为技术核心的微孔板检测仪进行平行测试。数据显示,PMT微孔板检测仪(PHERAstar FS)比CCD微孔板检测仪具有明显的性能优势:超过2倍的读数速度已经更加**的分析质量参数。更重要的是,PMT微孔板检测仪(PHERAstar FS)检���出几个CCD检测仪不能发现的更低亲合力的**“靶点”。PHERAstar FS,作为新的高通量**筛选的黃金标准,将是传统高通量**筛选中用于发现低亲合力复合物的代表性选择。
数据显示,PMT微孔板检测仪与CCD微孔板检测仪相比:
发现几个更低亲合力的**“hits”(活性化合物)
更好的Z’,分析窗和ΔF%
2倍以上的检测速度
实例分析:
在这里,我们采用的是Cisbio公司生产的IP-One HTRF®分析——该方案检测更低应答的胞内**信使磷酸肌醇(IP1),磷酸肌醇是三磷酸肌醇(IP3)的下游代谢产物。我们同时对比了两种不同的高通量筛选微孔板检测仪(PHERAstar FS和来自另外一个品牌的微孔板检测仪)对磷脂酰肌醇信号通路低亲合力抑制剂的检测结果来评估两种**筛选技术。
背景知识:
G-蛋白偶联受体(GPCRs)为跨膜蛋白,是介导细胞外刺激信号的关键角色。GPCRs与胞内一系列复杂的复合物相互作用调控非常大量的下游效应物质。其产物三磷酸肌醇(IP3)是其中一个**信使,是对Gq-蛋白偶联受体被激活的应答而产生的。然而,IP3的半衰期非常短,对于**筛选而言,是很难对其进行测定的。因此,对由IP3触发的钙释放的监测,作为该信号通路的下游信号被广泛应用。另外一个监测IP3的方法是检测磷酸肌醇(IP1)的累积,磷酸肌醇(IP1)是三磷酸肌醇(IP3)的下游代谢产物。
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图1.IP1的生物合成路径
利用IP1的稳定性和在细胞内的可累积性的优点,采用IP1单克隆抗体制备优化的均相时间分辨荧光(HTRF®)分析方法。HTRF® IP-One分析方法已经与多种现存的方法相比较且得到相似的复合效能数据,且在终点累积的IP1可用于测定缓作用复合物的作用,这个是钙流测定没办法做到的。HTRF® IP-One分析方法同时可通过定量组成性激活的G蛋白受体来测定反向激动剂,这是测定钙释放的方法所不能做到的。*后一点,HTRF® IP-One检测方法具有比钙流检测方法更好的分析稳健度和更低的假阳性。IP-One分析方法是Cisbio Bioassays在其**HTRF®技术上开发出来的。 (图2).
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该分析方法采用与IP1特异性结合的单克隆抗体,其原理是基于胞内累积的IP1与其竞争性结合从而抑制了HTRF®供体和受体之间的荧光共振能量转移(FRET)。建立一个IP1标准校正曲线可用于计算因复合物作用而引起的胞内累积的IP1的浓度,从而相应得到了复合物的浓度。
图2: IP-One HTRF 分析原理图
材料和方法:
黑色1536-孔微孔板,来自于Greiner公司
下一代PMT微孔板检测仪——PHERAstar FS,来自于德国BMG LABTECH公司
高通量CCD微孔板检测仪来自于另外生产商
PHERAstar FS配备高能脉冲氮分子激光,发射波长为337nm,同时配备了专用的同时双发射(SDE)直接光子测定时间分辨荧光模式。当激发铽(Tb)受体分子时,激光比宽光波段的氙闪灯具有更高的效率。与铕(Eu)相比,激光的高能量使得激发峰在337nm左右的铽穴合物有更高的分子激发效率。Greiner的1536-孔微孔板用于5μL体系的分析。如图3所示,1408个不同的复合物移液到微孔板的前44列中,阳性对照(POS,n=64)和阴性对照(NEG, n=64)移液到*后4列中。
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图3: BMG LABTECH多功能酶标仪PHERAstar FS
图4: 1536-孔微孔板布局
结果与讨论:
通过计算两个发射波长(Em 665 nm / Em 620 nm) 下的HTRF®比率来评估分析结果, 1536微孔板的3维表面图的尖峰表示得到的hits(活性化合物)。
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图5: 用PHERAstar FS测得的IP-One HTRF® 比率
图6: 用CCD微孔板检测仪测得的IP-One HTRF® 比率
当对比同一块微孔板在两个仪器上读数结果时,很明显只有PHERAstar FS给出了阳性结果,而CCD微孔板检测仪并没有给出明显的尖峰。
| PHERAstar FS | CCD微孔板检测仪 |
读数时间(1536孔微孔板) | 53秒 | 2分12秒 |
分析窗 | 6:1 | 2:1 |
Delta F% | 490 | 76 |
Z’值 | 0.70 | 0.24 |
结论:
用现有的处于领导地位的CCD微孔板检测仪不能发现的低亲合力复合物用PMT微孔板检测仪PHERAstarFS可以很容易的检测出来。
相关介绍:
HTRF: HTRF®是均相时间分辨荧光技术的简称,HTRF®技术是对TR-FRET技术的进一步改良,提供了更高的灵敏度和稳定性,为法国Cisbio公司的**技术。Cisbio Bioassays是一家超过50年历史的生命科学、医疗诊断和**研发公司。Cisbio Bioassays公司所销售的基于HTRF技术的产品包括:IP1, cAMP, Cellul’erk以及Tag-lite™细胞表面受体平台。在众多HTRF®的检测仪器中,BMG LABTECH的PHERAstar FS为Cisbio公司的推荐仪器。
BMG LABTECH:BMG LABTECH是一家超过20年历史的德国公司,多功能酶标仪是其**专注的产品,其多功能酶标仪以专业、**而著称于市场,是科研和**筛选的*佳选择。特别是FLUOstar Omega(荣获“2010年科学家的选择之*佳**筛选产品”)以及PHERAstar FS(Cisbio公司推荐HTRF®检测仪器)更是多功能酶标仪领域的骄子。香港伯齐科技有限公司为BMG LABTECH在中国大陆和香港、澳门的**授权代理商。
采用Cisbio IP-One和PHERAstar FS相结合所发表的文章:
1. Monitoring Gq-coupled receptor response through inositol phosphate quantification with the IP-One assay
2. Implementation of Cisbio’s HTRF® M1 muscarinic receptor related assays on CyBio liquid handling solutions for small and high throughput
3. Quantifying Ligand Bias at Seven-Transmembrane Receptors
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