ELISPOT(酶联免疫斑点法)技术实验操作步骤

    (1)将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上，用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗6遍，再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使*后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA 的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。

    (2)将阴性对照和细胞样品，如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC，用含10%FCS的培养基稀释至5×104～2×105个/孔如果条件可以达到更高的细胞数，建议可以尝试3×105～5×105个/孔，特别是在分泌细胞)，分装于ELISPOT板孔中，再加入特异的刺激物，如多肽或基因表达产物，提取的抗原等，阴性对照孔中只加入培养基(实验中*好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应)，阳性对照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或阳性多肽，37℃，体积比为5% CO2培养24～48h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10-12的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍*后斑点的显色。只要细胞可以正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，*后还是可以显示出斑点。

    (3) 用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的检测抗体，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP标记的链亲和素，室温孵育3h。

    (4) 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物室温下显色，待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数，并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原，则可用于ASC测定，这时，每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。

    完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断摸索反应的条件之后，得到了一块布满斑点的板，接下来要如何对这些斑点进行分析呢。如果利用显微镜人工技术无疑是太参有个人因素的实验了，实验结果肯定会被审稿人好好质疑一番。随后，有人使用数码相机拍摄下来后，使用photoshop进行处理、计数，这种方法也存在较多的个人因素。一项技术要普及，为广大研究人员所接受，就必需尽量减小人为的误差。所以，近年许多公司开始开发计算机辅助系统，使用系统设定的阈值对斑点进行人工智能计数。这样，由计算机将阴性对照中非特异反应斑点进行去除，同时由计算机进行统一计数，这样的实验结果置信度便大大提升了。目前判断的首要标准还是斑点的大小，但是做过电泳、同位素等的计算机成像的研究人员都遇到过一个问题：很多时候实验会产生一些较淡的斑点，用肉眼判断**是背景。所以在设计软件时也必需考虑到斑点深浅因素。计算机可以利用斑点的深浅、是否以中心为原点向四周减淡等特征对细胞分泌动力学特征进行分析，这项技术的成熟相信会使ELISPOT的应用范围更加扩宽。

    (5) ELISPOT 斑点的判读像多数的Cell-based分析技术一样，ELISPOT Cytokine技术也是相当耗时、耗劳力的工作。事实上到目前为止，以目视法判读少量细胞族群的特性如激活T细胞之**分泌，仍被视为是免疫学技术上的一大挑战。ELISPOT结果的判读常需要专聘、有经验的技术员才可以；有时就算有专职技师判读，使用传统的显微镜计算斑点数仍不免会偶有主观意见，而有所偏颇。