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Elispot直接间接法

Elispot可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞（直接法），或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞，然后放入已包被的孔中（间接法）。使用哪种方法基于：1）检测细胞的类型；2）希望得到的细胞量。如果细胞生成只需少量的细胞因子，使用直接法；如果细胞生成细胞因子较多，*好使用间接法。其它步骤一致。

刺激方法：建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC，使其产生IFNγ。

Elispot在培养液中稀释PBMC（如：RPMI 1640加2mM谷氨酸盐和10%加热失活的小牛血清），其中含1ng/ml PMA和500ng/ml娄诺霉素（Sigma, Saint Louis, MO）。加5X104至3x105个细胞到抗体包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同，基于细胞因子生成细胞的量，按不同情况作*佳选择。

试剂的准备：1. 10ml磷酸缓冲盐（PBS，10X）以90ml蒸馏水稀释；2. 0.22g脱脂乳用11ml稀释的PBS溶解，*终浓度为2%；3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀释的PBS，*终浓度为1%；4. 10ml浓缩洗涤液（200x）以1990ml蒸馏水稀释；5. 10ul亲和素碱性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀释6. 7ml酒精以3ml蒸馏水稀释，*终浓度为70%。

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