elispot的操作过程

   随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半衰期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。

1. 用50ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育1分钟。

2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。

3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 盖上板盖，4℃过夜。

4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。

5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS（见试剂准备），盖上板盖，室温下孵育2小时。

6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

7.用100ul PBS洗涤一次。

8.每孔加入100ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。

9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。

11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。

12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，室温下孵育2小时 。

13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。

14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，室温下孵育1小时。

15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。

16.每孔加入100ul BCIP/NBT。

17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。

18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。

此板在室温下避光保存。

   elispot使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的至癌物质，试验时带手套，使用后适当处理。对MAIPAN4510板，孵育时由于毛细作用，试剂渗入膜中，此液体难以洗去，因此导致背景增加。为了避免此情况，建议在步骤12时将板底移去，将膜倒转，用蒸馏水流冲洗，同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中，由于板底已移去，建议将MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步骤不变。