ELISPOT酶联免疫斑点检测注意事项

   细胞数：多肽刺激一般推荐2x10^5 左右；阳性对照一般2x10^4左右。

   涉及到感染类病毒，在去除细胞的一步中，应当进行灭活病毒处理，防止后续操作中感染病毒外泄：包膜病毒可在去除细胞过后加入100μl 1% Triton X-100 孵育30min；非包膜病毒可在去除细胞之后加入200μl 4%多聚甲醛常温放置5min。从而彻底杀灭孔中可能存在的活病毒，再进行后续操作。

   包被抗体：推荐5-10μg/mL/well，4℃至少孵育16h。

   板子保存：由于板子包被抗体之后，保存期很长，所以可以事先包被很多板子，以避免每次试验都需要提前小量提前准备。一般可4℃密封保存7天。也可在封闭的过程中长期保存。

   斑点特征： 1. 有一个深色的中心，周围有一圈逐渐变浅的晕； 2. 颜色深浅和spot大小取决于细胞因子分泌的多少； 3. 计数的时候应该只记录特征明显，斑点信号强，斑点大的，小而模糊的斑点可能是背景杂质或者是先天免疫系统免疫细胞分泌的少量细胞因子； 4. 背景中出现的很多小且深色的斑点，但他们一般缺乏边缘的晕。产生的原因可能是由携带有目的细胞因子的细胞膜破碎之后的碎片，被检测到了; 5. 斑点的大小一般在30-150μm左右。

   条纹状斑点：出现的原因可能是由于在孵育过程中，板子出现了晃动，导致分泌细胞出现了位移。一般尤其注意孵育过程中避免培养箱的晃动。

   预湿过程：由于是使用的乙醇对膜进行的预湿，所以预湿过后的清洗显得尤为重要，如若清洗不净，残存的乙醇将对细胞的培养以及抗体的包被产生很大的影响。

   同一批实验板子，在读板的时候应当使用相同的gate。

   TMB显色底物，如果单买的话，建议买Mabtech。并且注意一定是膜显色底物，而不是溶液显色底物。另外如果买一般的国产品牌，那就坐等实验失败了。