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ELISA测定的常用模式－－间接法测抗体

ELISA测定的常用模式－－间接法测抗体基本方法的操作如下:

1．将病原体的抗原在碳酸盐缓冲液中4~C过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

2．加入含待测抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗体就会与固阳上特异抗原反应而吸附于固相上。

3．加入酶标记的抗人IgG抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成固相抗原—待测抗体—酶标二抗复合物。

4．加入酶底物，温育显色测定（图2—6）。

间接法测抗体在目前应用*多的是丙型肝炎病毒抗体（抗HCV）、人**缺陷病毒抗体（抗HIV）以及梅毒螺旋体抗体等的测定。从上述的测定模式可见，间接法测抗体，严格地讲，所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，这是由酶标二抗体所决定的。

影响间接法测定抗体的一个较大的因素是包被抗原的纯度。现在间接法测抗体中所使用的抗原一般均为基因工程重组抗原，如HCV的NS3，NS4，NS5，HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋体TpNl5，TpNl7，TpN47等。基因工程抗原在纯化时应尽量去除用来表达的宿主如大肠杆菌的抗原，以免由于机体存在对这种宿主抗原的抗体而引起假阳性反应。此外，由于机体的IgG类抗体浓度较高，其中绝大部分为机体接触外界环境刺激所产生的非特异IgG，因此，为避免这些高浓度非特异IgG对固相的吸附所致的假阳性反应，通常需对待测样本做一定程度的稀释。

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