用elisa试剂盒检测样本的原理和步骤

人8羟基脱氧鸟苷

标本：细胞液、体液以及组织匀浆

使用说明书

本试剂盒仅供科研使用，不得用于临床及诊断使用！

预期应用

   ELISA法定量检测人细胞液、体液以及组织匀浆中8羟基脱氧鸟苷的含量。

试剂组成

自备物品

1.酶标仪（尽量提前预热）

2.微量加液器、吸头

3.蒸馏水或去离子水以及滤纸

样本的采集及保存

一般的生物标本包括有：

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的实质器官则要求：

1、   器官实质不能太小

2、   以采集实质性病灶区为佳：如**结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的地方为佳

3、   同一病例装入同一容器，并做好标记

4、   应在0-8℃的低温储存和运输

5、   实质性器官的处理：

5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨

5.2、加入约500ul的PBS/生理盐水，充分混匀

5.3、离心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）

二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式

1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸盐和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmpx5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-1000rmpx5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

2、胃液和唾液的采集方式一般现采现用，但是一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶，*好的采集的时间时空腹采集；

3、尿液的采集方式基本和唾液一样的，即现采现用，但是一般隔夜尿不采集；

4、组织提取液如肺泡灌洗液等，采集后离心分离，800-1000rmp x 5min，取上清，-20℃或4℃保存备用；

三．粪便以及天然孔排泄物：采集后一般现用PBS/生理盐水溶解，充分混匀，800-1000rmpx5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

四．活检组织一般进行穿刺检测，*常见的就是肝活检，像病毒性肝炎、脂肪肝、各种类型的肝硬化等进行活检简单方便、准确。

三、表达产物的检测

（一）真核表达产物

1、   细胞上清（分泌性蛋白）

1.2、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；

1.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmpx10min，吸取上清至另一10ml离心管中，10000rmpx10min，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；

2、   细胞裂解物（非分泌性蛋白）

2.1、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，然后用001MPBS(pH7.4)将细胞吹下至10ml离心管，500-800rmpx10min，弃上清，沉淀转移至1.5ml离心管中，DDW重悬，置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；

2.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmpx10min，弃上清，沉淀移至另一10ml离心管中，0.01MPBS(pH 7.4)重悬，500-800rmpx10min，弃上清，沉淀移至1.5ml离心管中，DDW重悬，置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；

（二）原核（大肠杆菌表达系统）表达产物

1、表达上清（非融合性蛋白）

直接将培养物和上清吸出，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；

2、菌体裂解物（融合性蛋白）

直接将培养物和上清吸出，10000rmpx10min，弃上清，沉淀用PBS洗一遍，500-800rmpx10min，弃上清，DDW重悬沉淀，冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmpx10min，取上清，-20℃或4℃保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；

注意事项

1.试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存。实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。

2．加样：加样时，要控制加样速度，避免**孔与*后一孔之见的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性；一般加样时间控制在10分钟内，如果样本数量过多，可使用多道移液器。

3.孵育：样品要在密闭的容器内进行孵育，严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。

4.洗涤：洗涤过程中反应孔中的残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，同时要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响*后的酶标仪读数。

5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。

6.建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。

7.建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。

操作步骤

1.         取出试剂盒，于室温（20-25℃）放置15-30分钟。实验过程应在室温（20-25℃）内进行。

2.         取出酶标板，按照标准品的次序分别加入50μl的标准品溶液于空白微孔中。

3.         空白微孔中加入50μl的样品，空白对照加入50μl的蒸馏水；

4.         在样品孔中加入10μl的生物素；（不含空白对照孔,切忌：生物素只加样品孔！）

5.         在各孔中加入100μl的酶标记溶液；（不含空白对照孔）

6.         将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育反应1小时；（在孵育箱中保持稳定的温度与湿度）

7.         充分清洗酶标板3-5次，保持各孔有充足的水压；（浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释）

8.         酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干；

9.         各孔加入显色剂A、B液各50μl；（不含空白对照孔）

10.       20-25℃下避光反应15分钟；

11.       各孔加入50μl终止液，终止反应；

结果判断

1.         30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；

2.         以OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；

3.         根据样品的OD值查找对应的浓度范围；

4.         敏感度：0.1ng/ml