纯化水微生物限度检查法验证方案
纯化水微生物限度检查法验证方案
1. 验证目的：纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。确认该方法适合于纯化水**、霉菌及酵母菌数测定。
2.职责
2.1验证委员会：负责验证方案及报告的批准并组织协调验证工作并签发验证证书。
2.2.验证组长
2.2.1.负责验证方案的起草
2.2.2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案的顺利实施。
2.2.3.负责验证报告的审批。
2.2.4.负责发放验证证书。
2.2.5.负责再验证周期的确认。
2．3. 质保部
2．3.1.负责验证方案审核
2．3.2.负责取样及对样品的检验
2．3.3.负责收集验证记录，并加以分析后，起草验证报告。
2．3.4.负责验证数据及结果的审核
按照我们现在现有的验证方案进行修改
3. 参照标准：
2015版中国药典非无菌产品检查 薄膜过滤法
4. 验证项目：
**、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
5. 合格标准：
试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于70%。
6. 试验材料：
6.1.
被验证产品：
品名 纯化水 取样点 总出水口 总回水口 R502（管道末端一个出水口）
检验量
5ml
6.2.
仪器设备：
6.2.1. 型自动座式压力蒸汽**器
6.2.2. 紫外分析暗箱
6.2.3. 双人净化工作台
6.2.4. 电热鼓风干燥箱
6.2.5.型生化培养箱 (23～28℃)
6.2.6.恒温培养箱(35～37℃)
6.2.7.数显隔水式恒温培养箱(30～35℃)
按照我们的仪器设备修改参数
6.3.
稀释剂： 0.9%无菌氯化钠溶液
6.4. 验证用培养基
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名称
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生产厂家
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批号
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营养琼脂培养基
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营养肉汤培养基
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玫瑰红钠琼脂培养基
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改良马丁培养基
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改良马丁琼脂培养基
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到研发寻找培养基，填上生产厂家和批号
6.5. 验证用菌株：(第3代)
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验证菌株
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培养基
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培养温度
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培养时间（小时）
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大肠埃希菌
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营养肉汤
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30—35℃
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金黄色葡萄球菌
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营养肉汤
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30—35℃
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枯草芽孢杆菌
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营养肉汤
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30—35℃
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白色***
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改良马丁培养基
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23—28℃
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黑曲霉菌
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改良马丁琼脂培养基
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23—28℃
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7. 菌液制备
7.1. 取经35～36℃培养18~24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、与枯草芽孢杆菌营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6~10-7约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。
7.2.取经24～25℃培养24~48小时的白色***改良马丁液体培养物1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。
7.3.取经24～25℃培养一周的黑曲霉菌斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液10ml将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热**）过滤，除去菌丝，收集孢子悬液至另一无菌试管内作为菌原液，取此孢子悬液0.1ml加到9.9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，稀释至10-5约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。
8.菌液计数：（每种菌液接种2个平皿）
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌分别划线接种至营养琼脂培养基，置35～36℃培养二天；白色***、黑曲霉分别划线接种至玫瑰红钠琼脂培养基，置24～25℃培养三天。
菌落计数结果（2个平皿计数取平均值）见下表 菌落计数结果（cfu∕ml）
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试验次数
|
10-5稀释
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10-6稀释
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10-7稀释
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1
|
2
|
3
|
1
|
2
|
3
|
1
|
2
|
3
|
|
大肠埃希菌
|
|
|
|
|
|
|
87.5
|
85
|
|
|
金黄色葡萄球菌
|
|
|
|
107.5
|
111.5
|
|
|
|
|
|
枯草芽孢杆菌
|
|
|
|
92.5
|
99.5
|
|
|
|
|
|
白色***
|
76
|
79
|
|
|
|
|
|
|
|
|
黑曲霉
|
51
|
50
|
|
|
|
|
|
|
|
9.验证方法： **、霉菌及酵母菌计数方法的验证至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
9.1.验证日期
9.
2.供试品名称及取样点： 纯化水 取样点 总出水口 总回水口 R502（管道末端一个出水口）
9.3.
供试品制备
方法建立: 2015版中国药典规定纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。但没规定取样量，由于所使用的滤膜孔径不大于0.45um ，直径为50mm， 规定每片滤膜上的菌落数应不超过100个。如果取样量过大，样品含菌量较多，就会造成**不宜分散，点计困难； 如果取样量过少，不能有效反映样品染菌量。为此参照注射用水微生物限度检查法建立以下几种方法进行了筛选试验:
方法1: 每张滤膜取100ml样品做为供试液直接过滤。
方法2: 每张滤膜取样品30ml用**0.9%氯化钠溶液70ml稀释后作为供试液(100ml)直接过滤。
方法3: 每张滤膜取样品10ml用**0.9%氯化钠溶液90ml稀释后作为供试液(100ml)直接过滤。
方法4: 每张滤膜取样品5ml用**0.9%氯化钠溶液95ml稀释后作为供试液(100ml)直接过滤。
验证试验采用方法4制备供试液，其它筛选试验另外报告。
9.3.1.试验组 取供试液100ml 和50～100cfu试验菌，分别过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。
9.3.2.菌液组 取50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数。
9.3.3. 供试品对照组 取供试液100ml，分别过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。**、霉菌及酵母菌各制备2个平皿，测定供试品本底菌数。
9.3.4. 稀释剂对照组 取0.9%无菌氯化钠溶液100ml和50～100cfu试验菌，分别过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于琼脂培养基平板上培养。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿菌落计数法测定其菌数, 每片滤膜上的菌落数应不超过100个。
9.4.
结果见表
独立试验一 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 总出水口
试验时间 年
月 日 完成时间 年 月 日
|
验证菌株
|
平皿号
|
试验组
个∕5ml
（回收率%）
|
菌液组
个∕ml
|
供试品对照组
个∕5ml
|
稀释剂对照组
个∕5ml
（回收率%）
|
|
大肠埃希菌
(培养48小时计数)
|
1
|
65
|
83
|
1
|
62
|
|
2
|
62
|
92
|
2
|
74
|
|
平均值
|
63.5（70.9%）
|
87.5
|
1.5
|
68（77.7%）
|
|
金黄色葡萄球菌
(培养48小时计数)
|
1
|
82
|
110
|
1
|
75
|
|
2
|
72
|
105
|
2
|
76
|
|
平均值
|
77（70.2%）
|
107.5
|
1.5
|
75.5（70.2%）
|
|
枯草芽孢杆菌
(培养48小时计数)
|
1
|
65
|
98
|
1
|
68
|
|
2
|
68
|
87
|
2
|
79
|
|
平均值
|
66.5（70.3%）
|
92.5
|
1.5
|
73.5（79.5%）
|
|
白色***
(培养72小时开始计数)
|
1
|
54
|
76
|
2
|
54
|
|
2
|
60
|
76
|
2
|
56
|
|
平均值
|
57（72.4%）
|
76
|
2
|
55（72.4%）
|
|
黑曲霉
(培养72小时开始计数)
|
1
|
51
|
53
|
2
|
49
|
|
2
|
50
|
49
|
2
|
54
|
|
平均值
|
50.5（95.1%）
|
51
|
2
|
51.5（100.9%）
|
备注：试验组及菌液组的霉菌及酵母菌培养72小时后开始计数, 供试品对照组的霉菌及酵母菌培养72小时后疑有菌落,但不宜观察。所以霉菌及酵母菌计数以培养96小时后计数为准。试验周期为4天。
结论：本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。
复核人 试验人
独立试验二 ：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 洗瓶用水
试验时间 年 月日 完成时间 年月日
|
验证菌株
|
平皿号
|
试验组
个∕5ml
（回收率%）
|
菌液组
个∕ml
|
供试品对照组
个∕5ml
|
稀释剂对照组
个∕5ml
（回收率%）
|
|
大肠埃希菌
(培养48小时计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
金黄色葡萄球菌
(培养48小时计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
枯草芽孢杆菌
(培养48小时计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
白色***
(培养72小时开始计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
黑曲霉
(培养72小时开始计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
备注：试验组及菌液组的霉菌及酵母菌培养72小时后开始计数, 供试品对照组的霉菌及酵母菌培养72小时后疑有菌落,但不宜观察。所以霉菌及酵母菌计数以培养96小时后计数为准。试验周期为4天。
结论：
本次试验各试验组的菌回收率和各稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,按标准规定, 本次试验结果符合规定。
复核人 试验人
独立试验三 ：：各试验组菌落计数（回收率%） 取样点 洗涤**
试验时间 年 月日 完成时间 年月日
|
验证菌株
|
平皿号
|
试验组
个∕5ml
（回收率%）
|
菌液组
个∕ml
|
供试品对照组
个∕5ml
|
稀释剂对照组
个∕5ml
（回收率%）
|
|
大肠埃希菌
(培养48小时计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
金黄色葡萄球菌
(培养48小时计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
枯草芽孢杆菌
(培养48小时计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
白色***
(培养72小时开始计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
|
黑曲霉
(培养72小时开始计数)
|
1
|
|
|
|
|
|
2
|
|
|
|
|
|
平均值
|
|
|
|
|
备注：试验组及菌液组的霉菌及酵母菌培养72小时后开始计数, 供试品对照组的霉菌及酵母菌培养72小时后疑有菌落,但不宜观察。所以霉菌及酵母菌计数以培养96小时后计数为准。试验周期为4天。
结论
通过三次独立试验,证明所采用的供试液制备方法(8.3. 方法4)及薄膜过滤法适合于纯化水**、霉菌及酵母菌数测定。
复核人 试验人
10. 结论
根据验证试验结果，纯化水微生物限度检查按照2010版中国药典二部附录XI J微生物限度检查法检验，**、霉菌及酵母菌计数可采用薄膜过滤法检查。
复核人 试验人
