**步：了解免yi沉淀是什么？我为什么要做免yi沉淀呢？
免yi沉淀（immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗体特异性反应，从特定混合物（通常是细胞裂解液或表达上清）中纯化富集目的蛋白的一种方法。传统的IP实验是抗体与目的蛋白结合后，再与蛋白Protein A /G（结合抗体Fc片段）偶联的琼脂糖或磁珠孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，复合物经过洗涤、洗脱后用于后续下游实验。IP是许多蛋白质相关研究的重要步骤，用于研究蛋白质的存在、相对丰度、蛋白表达的上下调、蛋白至稳定性及相互作用等。
（传统IP原理图）
总结：
IP的整个过程我需要用到的关键工具有：
一抗：选择能与我的样本发生反应，能做IP实验的一抗；
Potein A，Potein G或Protein A /G：Potein A，Potein G及Protein A /G与不同来源及亚型的免yi球蛋白结合能力不一样，如何选择？请参考https://www.abbkine.com/affinity-of-protein-a-protein-g-and-protein-ag/
选择指南:
货号
产品名称
BMR20500
PurKine™ Protein A Resin
BMR20504
PurKine™ Protein A Resin 4FF
BMR20600
PurKine™ Protein G Resin
BMR20604
PurKine™ Protein G Resin 4FF
BMR20704
PurKine™ Protein A/G Resin 4FF
**步：发现竟然没有合适的一抗来满足我需要做的免yi沉淀？
某些目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免yi沉淀，如抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，无法与目的蛋白相互作用或抗体选择不合适，所选抗体不能识别处于天然构象的蛋白等，可以采用一个表位标记蛋白后，再选择针对此表位的标签抗体来进行免yi沉淀。厂家会推出一些常见的标签抗体用于IP实验，涉及flag、HA、His、Myc等标签，以满足大多数客户的需求。
特别是琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体，能*大限度优化免yi沉淀实验，节省时间和成本。
1）原理：省去了Protein A/G与抗原-抗体复合物结合的步骤，且解决了Protein A/G和抗体结合能力弱的问题。偶联抗体直接和目标蛋白结合后，通过离心或使用磁力架，将目标蛋白从细胞裂解液中分离出来。高特异性单克隆标签抗体可实现高产量和高纯度，稳定、预封闭的填料及特异性抗体减少了免yi沉淀过程中的非特异性结合。
（琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体应用于IP）
2）选择指南：
A02010AGB
Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Agarose
A02010MGB
Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Magnetic Beads
A02040AGB
Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Agarose
A02040MGB
Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Magnetic Beads
A02050AGB
Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Agarose
A02050MGB
Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Magnetic Beads
A02060AGB
Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Agarose
A02060MGB
Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Magnetic Beads
第三步：免yi沉淀后WB (IP-WB)出现重链、轻链干扰，怎么办？
在免yi沉淀实验后的WB验证环节中，当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时，通常会出现对应免yi沉淀一抗变性后产生的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰。如何避免干扰，
方法一：选择只和重链或轻链反应的二抗。如果目标蛋白分子量小于30KD，为了避免抗体轻链的干扰，选择重链特异性二抗；如果目标蛋白分子量大于30KD，为了避免抗体重链的干扰，选择轻链特异性二抗；
选择指南：
描述
A25012
IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS
轻链特异性
A25022
IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS
A25112
IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG HCS
重链特异性
A25222
IPKine™ HRP, Goat Anti-Rabbit IgG HCS
“使用IPKine Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 轻链特异性二抗检测NUP50蛋白的IP结果，上乘解决重链干扰问题！ ” CAT #: A25022
方法二：选择WB一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰；
方法三：选择HRP直接偶联的WB一抗，省去二抗的步骤。
免yi沉淀三步击破，你掌握了吗？如有疑问，欢迎来撩！