彗星实验(Comet assay)也被称为单细胞凝胶电泳实验(Single cell gel electrophoresis,SCGE),是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的技术。当各种内源性和外源性 DNA 损伤因子诱发细胞 DNA 链断裂时,其超螺旋结构受到破坏,在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜等膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA 以及其他成分均扩散到电解液中,而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。电泳过程中,如果DNA没有损伤,则将停留在原位,染色后呈圆形的荧光团,无拖尾出现。如果DNA受损,断裂的碎片进入到凝胶中,在电场的作用下,DNA碎片离开原位向阳极迁移,形成拖尾。DNA受损越严重,断裂越多,产生的碎片就越多、越小,则向阳极迁移的DNA碎片量就越多,迁移距离也越长,荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。
目前有两种常见的彗星实验检测方式——碱性处理&中性处理。在碱性处理条件下,DNA发生变性,因而可检测包括单链及双链断裂在内的所有DNA 损伤;在中性处理条件下,DNA 维持双链构象,因而仅可以检测双链断裂。
实验大体流程如下:
1. 制备单细胞悬浮液,在 37℃ 条件下,悬浮液与低熔点琼脂糖(LM琼脂糖)混合;
2. 将琼脂糖、细胞混合物涂布在预处理的载玻片上;
3. 4℃条件下用裂解液处理30-60min或过夜,裂解液由去垢剂及高盐溶液组成,可去除多余的细胞膜及组蛋白;
4. 将载玻片浸入电泳溶液中;
5. 进行凝胶电泳,随后,中和载玻片,待LM琼脂糖完全干燥后,用荧光染料染色,并于荧光显微镜下观察DNA损伤程度。
注:*常用的荧光染料是SYBR Gold,但荧光染料的观察需要荧光显微镜。如果选择银染,使用标准的光学显微镜观察即可。
图片处理
在拍照时以tif格式保存图片,然后用CASP彗星分析软件分析,如下图是软件打开的界面➙
接下来➙导入图片,用白色画框选中要分析的区域。下图中的“调整”项可以调整画框的位置以包含整个细胞,开始分析前要点击“开始”,然后点“分析”,再点“保存”,这样一张图的数据就分析完了,数据会保存在系统里。点击“翻页”可以继续分析下一张图。
分析完所有图片后导出数据到Excel表格,保留TailDNA%(尾部DNA百分含量),TailLength(尾长),TailMoment(尾矩)三列数据。根据细胞尾部的DNA百分含量(即TailDNA%),将采集的细胞图像分为5级:彗星尾部荧光强度(TailDNA%)占总强度为0-6%是0级;6.1%-17.0%是1级;17.1%-35.0%是2级;35.1%-60.0%是3级;60.1%-100.0%是4级。
彗星率等于彗星细胞数目(除去0级细胞)占总细胞数目的百分比。任意值等于各等级细胞的百分比与其对应的级别号的乘积之和,它可以综合反映细胞的DNA损伤情况。*后,综合分析Tail DNA%、Tail length、Tail moment、彗星率和任意值,共5个指标比较细胞的DNA损伤程度。
Trevigen作为一家专注于开发细胞凋亡、DNA损伤和修复、肿瘤细胞功能与行为等相关研究产品的美国生物技术公司,拥有彗星实验全线产品:
1。彗星分析专用玻片,货号:4250-004-03
2。彗星分析银染试剂盒,货号:4254-200-K
3。彗星分析96孔电泳系统起始套装,货号:4253-096-ESK
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