聊一聊荧光检测器的工作原理
聊一聊荧光检测器的工作原理
1、荧光的产生
从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的某些电子从基态中的*低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。电子在同类分子或其他分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到**电子激发态中的*低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。由*低振动能级下降到基态中的某些不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要长于分子吸收的紫外光波长，通常在可见光范围内。荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光。
2、定量基础
在光致发光中，发射出的辐射总依赖于所吸收的辐射量。由于一个受激发的分子回到基态时可能以无辐射跃迁的形式产生能量损失，因而发射辐射的光子数通常都少于吸收辐射的光子数，它以量子效率Q来表示。
在固定的实验条件下，量子效率是个常数，通常Q小于1。对可用荧光检测的物质来说，
Q值一般在0.1～0.9之间。荧光强度F与吸收光强度成正比.
对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。在其他因素保持不变的条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比,这是荧光检测器的定量基础。荧光检测器属于溶质型检测器，可直接用于定量分析。
3、激发光谱和发射光谱
荧光涉及光的吸收和发射两个过程，因此任何荧光化合物，都有两种特征的光谱：激发光谱(exitation spectrum)和发射光谱(emission spectrum)。
荧光属于光致发光，需选择合适的激发光波长(Ex)以利于检测。激发波长可通过荧光化合物的激发光谱来确定。激发光谱的具体检测办法是通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光激发荧光化合物，产生的荧光通过固定波长的发射单色器，由光检测元件检测。*终得到荧光强度对激发波长的关系曲线就是激发光谱。在激发光谱曲线的***长处，处于激发态的分子数目*多，即所吸收的光能量也*多，能产生*强的荧光。当考虑灵敏度时，测定应选择*大激发波长。
一般所说的荧光光谱，实际上仅指荧光发射光谱。它是在激发单色器波长固定时，发射单色器进行波长扫描所得的荧光强度随荧光波长(即发射波长，Em)变化的曲线。荧光光谱可供鉴别荧光物质，并作为荧光测定时选择合适的测定波长的依据。
另外，由于荧光测量仪器的特性，使光源的能量分布、单色器的透射率和检测器的响应等性能会随波长而变，所以同一化合物在不同的仪器上会得到不同的光谱图，且彼此间无类比性，这种光谱称为表观光谱。要使同一化合物在不同的仪器上能得到具有相同特性的荧光光谱，则需要对仪器的上述特性进行校正。经过校正的光谱称为真正的荧光光谱。
激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数。选择合适的激发波长和发射波长，对检测的灵敏度和选择性都很重要，尤其是可以较大程度地提高检测灵敏度。
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