mMESSAGE mMACHINE® Kit

mMESSAGE mMACHINE ^®Kit

                                                                     ——High Yield CappedRNA Transcription Kit

原理：

mMESSAGE mMACHINE^®high yield capped RNA转录试剂盒是Ambion公司的**技术，专门设计用于体外高产量合成帽状RNA（即合成RNA的5端带帽状结构），帽状RNA模拟了大多数真核生物体内发现的mRNA结构。试剂盒内的帽状类似物[m7G(5)ppp(5)G]与4种核苷酸混合在单一溶液内，简化了反应步骤。另外帽状类似物：GTP经优化设计为1:4，*大化转录生成RNA和帽状RNA所占比例。20ul的反应体系加入1µgDNA模板在2h内可以体外合成15-35 µg 7-甲基鸟苷帽状RNA，其产量是传统体外转录反应的10-50倍。

优势：

1）一步法直接合成带帽状结构的RNA，其结构与大多数真核生物体内的mRNA结构相同；

2）试剂盒内酶混合液含RNase抑制剂，保护RNA不被降解；

3）试剂盒含对照模板（Xenopus elongation factor 1a, pTRI Xef），以检测试剂盒的转录效率；

应用：

帽状RNA可直接用于下游实验：显微注射入卵母细胞，体外翻译，转染或者其他。

试剂盒成分：（25 reactions）

1.75 ml，Nuclease-free Water。

50μLEnzyme Mix (SP6, T7, or T3)，50%甘油缓冲液含RNA聚合酶、Rnase抑制剂和其他。

50 μL，10X Reaction Buffer (SP6, T7, or T3) ，含盐类、缓冲液、DTT和其他成分。

250μL，2X NTP/CAP (SP6, T7, or T3)，一种中性缓冲液含有ATP/CTP/UTP/GTP/帽状类似物。

100μL GTP，20 mM in SP6 Kits; 30 mM in T3 and T7 Kits。

100 μL，TURBO DNase (2 U/μL)。

10 μL，pTRI-Xef, 0.5 mg/mL (Control Template)。

1 ml，Ammonium Acetate Stop Solution。

1.4 mL，Lithium Chloride Precipitation Solution。

1.4 mL，Gel Loading Buffer II。

实验材料（自行准备）：

DNA模板：待转录的DNA序列上游必须带有正确的RNA聚合酶启动位点（T7，T3或SP6）；

标记核苷酸(选择性)：[α-³²P] UTP or [α-³²P]CTP可加入反应体系用作追踪元素，方便定量检测RNA合成量；

合成RNA纯化试剂（选择性）：缓冲液或饱和酚/氯仿，异丙醇，离心柱；

DNA模板（注意事项）：

（1）试剂盒选择：根据带转录的DNA序列上游带有的RNA聚合酶启动位点（T7，T3或SP6）选择对应的试剂盒；

（2）模板浓度：推荐使用0.5 μg/μL水溶液或TE溶液；

（3）模板大小：*佳长度是0.3-5.0kb，可用于更长或更短的模板，需适当调整反应条件；

（4）模板方向：若合成sense RNA(正义RNA)，使用RNA聚合酶对应的**启动子在5端或者蛋白质编码区的N末端；如果模板含有质粒，经多克隆位点内切酶线性化后启动子处于相反位置；若合成antisense RNA（反义RNA），使用RNA聚合酶对应的**启动子在3或者蛋白质编码区的C末端；

产品信息：现货供应！

参考文献：

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反应步骤：