摘要：目的 探讨鹰嘴豆异黄酮提取物(CIE)对阿尔茨海默病(AD)炎症模型大鼠记忆能力的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 采用脂多糖右侧海马注射制备 AD 模型，40 只 Wistar 大鼠随机分为 CIE 高、中、低剂量组(100，50，25 mg·kg-1)、模型组和对照组(生理盐水)，灌胃给药 28 d 后，采用 Y-迷宫测试大鼠的学习记忆能力，采用**组化法检测大鼠海马内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞白介素-6(IL-6)的表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠学习记忆能力明显下降，尝试次数均明显增加(P<0.01)，TNF-α 和 IL-6 的表达水平有显著提高(P<0.01)；经过灌胃给药不同剂量的 CIE 后，与模型组相比，大鼠学习记忆的尝试次数和 TNF-α、IL-6 的表达水平有不同程度的降低，并呈现一定的剂量依赖性，特别在中、高剂量组差异具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。结论 CIE 对 AD 模型大鼠的学习记忆能力有明显的改善作用，其作用机制Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响
可能与抑制模型大鼠海马组织内 TNF-α 和 IL-6 的表达有关，进而抑制海马神经元的炎症反应。
关键词：鹰嘴豆异黄酮提取物；阿尔茨海默病；肿瘤坏死因子-α；细胞白介素-6；海马
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性**，其病因和发病机制十分复杂。有证据显示，在 AD 发病初期及病程进展过程中，海马的形态结构、神经病理会发生一系列的变化，并在 AD 的发病与发展中具有重要作用。**神经系统的炎症反应是 AD 的关键性特征之一，所涉及的多种炎性细胞因子加速了 AD 的整个病变过程，因此有研究提出，****可能延缓神经元退行性病变的速度，或将有利于缓解 AD 患者的症状。鹰嘴豆 Cicer arietinum L.属于豆科，味甘、性平、无毒，具有补中**、温肾**、润肺止咳等功效。有研究表明，鹰嘴豆具有广泛的药理活性，包括保护心血管、抗肿瘤、调脂等功能，这与其含有的活性成分异黄酮有着密切的关系，如芒柄花黄素、鸡豆黄素 A。更有研究显示，鹰Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响豆 异 黄 酮 提 取 物 (Cicer arietinum isoflavoneextract，CIE)可改善 D-半乳糖衰老模型小鼠的学习记忆能力，其作用机制与其抗氧化能力有关。而 CIE 是否能通过影响 AD 病程的炎症反应及炎症因子的表达，从而缓解 AD 的症状，国内外文献未见报道。本实验旨在观察 CIE 对 AD 模型大鼠学习记忆能力的影响，并探讨其可能的机制，为抗 AD 的**研发提供实验依据和新的研究思路。
1 材料
1.1 动物
成年 Wistar 大鼠 40 只，♂，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2012-0002，清洁级，体质量 200~250 g。
1.2 药品、试剂与仪器
CIE 为自行制备，紫外分光光度法测得异黄酮含量为 39.0%；脂多糖(Sigma 公司，批号：B5-L2880)，用生理盐水配成 5 μg·μL-1的溶液；TNF-α(批号：20130917)、IL-6(批号：20131025)、非结合多克隆兔抗体(批号：20131025)、S-P 试剂盒(批号：20130818)及 DAB 显色试剂盒(批号：20120320)均购自武汉博士德生物工程有限公司；UV-3100 紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)； XR-XY1031 Y-迷宫刺激器(上海欣软信息科技有限公司)；大鼠脑立体定位仪(美国 Stoelting 公司)；JD801 图像分析仪(江苏捷达科技公司)。
2 方法
2.1 动物分组与给药
将 Wistar 大鼠，♂，随机分为 5 组：CIE 高、中、低剂量组(100，50，25 mg·kg-1)、模型组和对照组，每组 8 只，安静清洁环境下 4 只一笼饲养，温度控制在(25±1)℃，相对湿度 60%，正常饮食。造模手术后第 2 天开始，各试验组均灌胃给药进行干预，每日 1 次，模型组和对照组给予等量的生理盐水。
2.2 模型制备
采用 2%****钠(40~50 mg·kg-1)腹腔注射对大鼠进行麻醉，将其固定于脑立体定位仪上，剪去头顶部毛发，碘酊**后切开皮肤，参照《大鼠脑立体定位图谱》选择右侧侧脑室为注射靶区，于前囟后 1.0 mm，中线旁开 1.6 mm 处，用柔性颅骨钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，用微量注射器缓慢自脑表面垂直进针 3.4 mm，将 5 μg·μL1的脂多糖溶液缓慢注入，2 min 后将注射针缓慢抽出，用骨蜡封住钻孔，缝合切口。对照组注射等量的生理盐水。
2.3 Y-迷宫学习记忆能力测试
大鼠连续灌胃给药 28 d 后，采用 Y-型迷宫测试大鼠的学习记忆能力。实验分 2 次进行，每次测试固定在上午 8：00~12：00，测试环境应保持安静，避光。第 1 次为学习能力测试：训练前，将大鼠放入 Y-迷宫自由活动适应 5 min，适应后将Ⅰ臂作为**臂，Ⅱ、Ⅲ臂给予 60 V，0.5~0.7 mA的电刺激，持续 2 s，以大鼠被电击后一次性逃离至**臂为正确反应，否则判定为错误反应。之后的训练将**臂作为起始臂，将大鼠放置于**臂 1 min 加强记忆，**臂按照Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的顺序依次改变，其他臂再次给予电刺激，依次类推，以测试达到连续 10 次中有 9 次正确反应所需的电击次数作为评价大鼠学习能力的指标。第 2次为记忆能力测试：学习能力测试后 48 h 后，以同样的方法测试，以测试达到连续 10 次中有 9 次正确反应所需的电击次数作为评价大鼠记忆能力的指标。
2.4 取材方法和样品制备
在 Y-型迷宫学习记忆能力测试后，用 2%****钠(40~50 mg·kg-1)腹腔注射对大鼠进行麻醉，麻醉后剪开胸腔，使心脏暴露，将灌流针从大鼠的左心室插入至升主动脉，剪开右心耳，并同时快速灌注 37 ℃的生理盐水至流出液清亮，然后用4%多聚甲醛溶液灌注固定 1 h。灌注结束后迅速端头取脑，去除嗅球和小脑，将组织放入 4%多聚甲醛溶液中进行后固定 6 h。固定后修脑，取包含海马组织的脑区经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，切片备用，厚度为 4 μm。
2.5 大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达的检测
大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达的检测，按照博士德生物工程有限公司提供的**组化试剂盒说明书进行操作。切片制作完成后，每张切片随机观察 5 个高倍视野下的海马区域，根据 TNF-α和 IL-6 蛋白的表达，利用生物医学图像分析系统对视野进行灰度值测定并记录结果
2.6 统计学分析
计量资料以 x ± s表示，采用 SPSS 16.0 统计软件进行统计分析。2 组间的比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析及 Dunnett’s 检验。
3 结果
3.1 CIE 对 AD 模型大鼠 Y-迷宫学习记忆能力的影响
在学习能力测试中，与对照组相比，模型组大鼠所需要的尝试次数明显增加(P<0.01)，说明造模成功的 AD 大鼠学习能力降低。而灌胃给予不同剂量的 CIE 后，尝试次数均有所下降，并呈现一定的剂量依赖性，中、高剂量组的差异具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。同样在记忆能力测试中，模型组大鼠所需的尝试次数明显高于对照组(P<0.01)，与模型组比较，不同剂量 CIE 组的尝试次数均有所下降，50 和 100 mg·kg-1剂量组的差异具有统计学意义(P<0.01)，且具有一定的剂量相关性。Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响
3.2 CIE 对 AD 模型大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达水平的影响
经图像分析系统测试显示，模型组大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值显著低于对照组(P<0.01)，提示模型组大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6的表达呈现强阳性；CIE 各剂量组 TNF-α 和 IL-6的平均灰度值相对于模型组有一定的提高，说明TNF-α 和 IL-6 的表达降低，且差异在 CIE 中、高剂量组中具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。结果见表 2。
4 讨论
AD 发病机制虽然复杂，但目前学界公认炎性反应在 AD 的发病过程中起着重要的作用。有国外研究显示，大量 TNF-α 等炎性细胞因子会存在AD 的神经病例过程中，异常高度表达的 TNF-α提示其可能与 AD 的发病有关。IL-6 是一种炎症性细胞因子，处于 AD **神经系统炎症反应的中心位置，参与 AD 患者炎症级联反应的形成。Sokolova 等通过大量试验表明，IL-6 在 AD 患者脑组织中呈显著上调趋势，认为 IL-6 具有神经元毒性作用，参与 AD 的发病过程。与对照组相比，本研究中的模型组大鼠学习记忆的尝试次数明显增加(P<0.01)，海马内 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值显著降低(P<0.01)，提示表达呈现强阳性，说明AD 模型大鼠学习记忆能力显著降低，**神经系统炎症反应明显，进一步证明了该模型的可靠，可以用于炎症反应介导的 AD 研究。鹰嘴豆由于富含具有较强抗氧化活性的异黄酮类化合物，近几年成为天然抗氧化剂开发的研究热点。有研究表明，CIE 可能通过抗氧化机制改善 D-半乳糖致衰老模型小鼠的学习记忆能力，而氧化应激不仅直接参与了 AD 的发病机制，更重要的是通过其连接中介效应放大了 AD 神经炎性病变的发生。本研究结果显示，CIE 各剂量组TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值相对于模型组有一定的提高，提示海马内 TNF-α 和 IL-6 的表达降低，并呈现一定的剂量依赖性，且差异在 CIE 中、高剂量组中具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。说明 CIE 对海马组织神经胶质细胞的活化增生及TNF-α、IL-6 等炎症因子的产生有一定的抑制作用，在一定程度上阻断了 AD 模型大鼠海马内的炎症损伤，而产生一定的保护作用。然而，CIE 是通过何种机制和通路对 TNF-α、IL-6 等炎症因子起
到精准调控，需要进一步地深入研究和探讨。总之，CIE 对 AD 模型大鼠学习记忆障碍有一定的改善作用，其作用机制可能与抑制大鼠海马组织内 TNF-α 和 IL-6 的表达有关，并进而抑制海马神经元的炎症反应。
