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摘要:目的 探讨鹰嘴豆异黄酮提取物(CIE)对阿尔茨海默病(AD)炎症模型大鼠记忆能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 采用脂多糖右侧海马注射制备 AD 模型,40 只 Wistar 大鼠随机分为 CIE 高、中、低剂量组(100,50,25 mg·kg-1)、模型组和对照组(生理盐水),灌胃给药 28 d 后,采用 Y-迷宫测试大鼠的学习记忆能力,采用**组化法检测大鼠海马内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞白介素-6(IL-6)的表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠学习记忆能力明显下降,尝试次数均明显增加(P<0.01),TNF-α 和 IL-6 的表达水平有显著提高(P<0.01);经过灌胃给药不同剂量的 CIE 后,与模型组相比,大鼠学习记忆的尝试次数和 TNF-α、IL-6 的表达水平有不同程度的降低,并呈现一定的剂量依赖性,特别在中、高剂量组差异具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。结论 CIE 对 AD 模型大鼠的学习记忆能力有明显的改善作用,其作用机制Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响
可能与抑制模型大鼠海马组织内 TNF-α 和 IL-6 的表达有关,进而抑制海马神经元的炎症反应。
关键词:鹰嘴豆异黄酮提取物;阿尔茨海默病;肿瘤坏死因子-α;细胞白介素-6;海马
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性**,其病因和发病机制十分复杂。有证据显示,在 AD 发病初期及病程进展过程中,海马的形态结构、神经病理会发生一系列的变化,并在 AD 的发病与发展中具有重要作用。**神经系统的炎症反应是 AD 的关键性特征之一,所涉及的多种炎性细胞因子加速了 AD 的整个病变过程,因此有研究提出,****可能延缓神经元退行性病变的速度,或将有利于缓解 AD 患者的症状。鹰嘴豆 Cicer arietinum L.属于豆科,味甘、性平、无毒,具有补中**、温肾**、润肺止咳等功效。有研究表明,鹰嘴豆具有广泛的药理活性,包括保护心血管、抗肿瘤、调脂等功能,这与其含有的活性成分异黄酮有着密切的关系,如芒柄花黄素、鸡豆黄素 A。更有研究显示,鹰Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响豆 异 黄 酮 提 取 物 (Cicer arietinum isoflavoneextract,CIE)可改善 D-半乳糖衰老模型小鼠的学习记忆能力,其作用机制与其抗氧化能力有关。而 CIE 是否能通过影响 AD 病程的炎症反应及炎症因子的表达,从而缓解 AD 的症状,国内外文献未见报道。本实验旨在观察 CIE 对 AD 模型大鼠学习记忆能力的影响,并探讨其可能的机制,为抗 AD 的**研发提供实验依据和新的研究思路。
1 材料
1.1 动物
成年 Wistar 大鼠 40 只,♂,购自上海斯莱克实验动物有限公司,合格证号:SCXK(沪)2012-0002,清洁级,体质量 200~250 g。
1.2 药品、试剂与仪器
CIE 为自行制备,紫外分光光度法测得异黄酮含量为 39.0%;脂多糖(Sigma 公司,批号:B5-L2880),用生理盐水配成 5 μg·μL-1的溶液;TNF-α(批号:20130917)、IL-6(批号:20131025)、非结合多克隆兔抗体(批号:20131025)、S-P 试剂盒(批号:20130818)及 DAB 显色试剂盒(批号:20120320)均购自武汉博士德生物工程有限公司;UV-3100 紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司); XR-XY1031 Y-迷宫刺激器(上海欣软信息科技有限公司);大鼠脑立体定位仪(美国 Stoelting 公司);JD801 图像分析仪(江苏捷达科技公司)。
2 方法
2.1 动物分组与给药
将 Wistar 大鼠,♂,随机分为 5 组:CIE 高、中、低剂量组(100,50,25 mg·kg-1)、模型组和对照组,每组 8 只,安静清洁环境下 4 只一笼饲养,温度控制在(25±1)℃,相对湿度 60%,正常饮食。造模手术后第 2 天开始,各试验组均灌胃给药进行干预,每日 1 次,模型组和对照组给予等量的生理盐水。
2.2 模型制备
采用 2%****钠(40~50 mg·kg-1)腹腔注射对大鼠进行麻醉,将其固定于脑立体定位仪上,剪去头顶部毛发,碘酊**后切开皮肤,参照《大鼠脑立体定位图谱》选择右侧侧脑室为注射靶区,于前囟后 1.0 mm,中线旁开 1.6 mm 处,用柔性颅骨钻钻开颅骨,暴露硬脑膜,用微量注射器缓慢自脑表面垂直进针 3.4 mm,将 5 μg·μL1的脂多糖溶液缓慢注入,2 min 后将注射针缓慢抽出,用骨蜡封住钻孔,缝合切口。对照组注射等量的生理盐水。
2.3 Y-迷宫学习记忆能力测试
大鼠连续灌胃给药 28 d 后,采用 Y-型迷宫测试大鼠的学习记忆能力。实验分 2 次进行,每次测试固定在上午 8:00~12:00,测试环境应保持安静,避光。第 1 次为学习能力测试:训练前,将大鼠放入 Y-迷宫自由活动适应 5 min,适应后将Ⅰ臂作为**臂,Ⅱ、Ⅲ臂给予 60 V,0.5~0.7 mA的电刺激,持续 2 s,以大鼠被电击后一次性逃离至**臂为正确反应,否则判定为错误反应。之后的训练将**臂作为起始臂,将大鼠放置于**臂 1 min 加强记忆,**臂按照Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的顺序依次改变,其他臂再次给予电刺激,依次类推,以测试达到连续 10 次中有 9 次正确反应所需的电击次数作为评价大鼠学习能力的指标。第 2次为记忆能力测试:学习能力测试后 48 h 后,以同样的方法测试,以测试达到连续 10 次中有 9 次正确反应所需的电击次数作为评价大鼠记忆能力的指标。
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2.4 取材方法和样品制备
在 Y-型迷宫学习记忆能力测试后,用 2%****钠(40~50 mg·kg-1)腹腔注射对大鼠进行麻醉,麻醉后剪开胸腔,使心脏暴露,将灌流针从大鼠的左心室插入至升主动脉,剪开右心耳,并同时快速灌注 37 ℃的生理盐水至流出液清亮,然后用4%多聚甲醛溶液灌注固定 1 h。灌注结束后迅速端头取脑,去��嗅球和小脑,将组织放入 4%多聚甲醛溶液中进行后固定 6 h。固定后修脑,取包含海马组织的脑区经梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋后,切片备用,厚度为 4 μm。
2.5 大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达的检测
大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达的检测,按照博士德生物工程有限公司提供的**组化试剂盒说明书进行操作。切片制作完成后,每张切片随机观察 5 个高倍视野下的海马区域,根据 TNF-α和 IL-6 蛋白的表达,利用生物医学图像分析系统对视野进行灰度值测定并记录结果
2.6 统计学分析
计量资料以 x ± s表示,采用 SPSS 16.0 统计软件进行统计分析。2 组间的比较采用 t 检验,多组间比较采用单因素方差分析及 Dunnett’s 检验。
3 结果
3.1 CIE 对 AD 模型大鼠 Y-迷宫学习记忆能力的影响
在学习能力测试中,与对照组相比,模型组大鼠所需要的尝试次数明显增加(P<0.01),说明造模成功的 AD 大鼠学习能力降低。而灌胃给予不同剂量的 CIE 后,尝试次数均有所下降,并呈现一定的剂量依赖性,中、高剂量组的差异具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。同样在记忆能力测试中,模型组大鼠所需的尝试次数明显高于对照组(P<0.01),与模型组比较,不同剂量 CIE 组的尝试次数均有所下降,50 和 100 mg·kg-1剂量组的差异具有统计学意义(P<0.01),且具有一定的剂量相关性。Y迷宫对大鼠学习记忆能力表达的影响
3.2 CIE 对 AD 模型大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 表达水平的影响
经图像分析系统测试显示,模型组大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值显著低于对照组(P<0.01),提示模型组大鼠海马内 TNF-α 和 IL-6的表达呈现强阳性;CIE 各剂量组 TNF-α 和 IL-6的平均灰度值相对于模型组有一定的提高,说明TNF-α 和 IL-6 的表达降低,且差异在 CIE 中、高剂量组中具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。结果见表 2。
4 讨论
AD 发病机制虽然复杂,但目前学界公认炎性反应在 AD 的发病过程中起着重要的作用。有国外研究显示,大量 TNF-α 等炎性细胞因子会存在AD 的神经病例过程中,异常高度表达的 TNF-α提示其可能与 AD 的发病有关。IL-6 是一种炎症性细胞因子,处于 AD **神经系统炎症反应的中心位置,参与 AD 患者炎症级联反应的形成。Sokolova 等通过大量试验表明,IL-6 在 AD 患者脑组织中呈显著上调趋势,认为 IL-6 具有神经元毒性作用,参与 AD 的发病过程。与对照组相比,本研究中的模型组大鼠学习记忆的尝试次数明显增加(P<0.01),海马内 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值显著降低(P<0.01),提示表达呈现强阳性,说明AD 模型大鼠学习记忆能力显著降低,**神经系统炎症反应明显,进一步证明了该模型的可靠,可以用于炎症反应介导的 AD 研究。鹰嘴豆由于富含具有较强抗氧化活性的异黄酮类化合物,近几年成为天然抗氧化剂开发的研究热点。有研究表明,CIE 可能通过抗氧化机制改善 D-半乳糖致衰老模型小鼠的学习记忆能力,而氧化应激不仅直接参与了 AD 的发病机制,更重要的是通过其连接中介效应放大了 AD 神经炎性病变的发生。本研究结果显示,CIE 各剂量组TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值相对于模型组有一定的提高,提示海马内 TNF-α 和 IL-6 的表达降低,并呈现一定的剂量依赖性,且差异在 CIE 中、高剂量组中具有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。说明 CIE 对海马组织神经胶质细胞的活化增生及TNF-α、IL-6 等炎症因子的产生有一定的抑制作用,在一定程度上阻断了 AD 模型大鼠海马内的炎症损伤,而产生一定的保护作用。然而,CIE 是通过何种机制和通路对 TNF-α、IL-6 等炎症因子起
到精准调控,需要进一步地深入研究和探讨。总之,CIE 对 AD 模型大鼠学习记忆障碍有一定的改善作用,其作用机制可能与抑制大鼠海马组织内 TNF-α 和 IL-6 的表达有关,并进而抑制海马神经元的炎症反应。