***是否影响发育期**神经系统的正常发育一���是悬而未决而又具有重要意义的课题。传统观点推断各种***在体内的短暂作用不会引起神经元及其连接的病理改变，但缺乏实验观察依据。相反，近年许多研究发现在脑发育的关键阶段，动物神经元活性的短暂改变（过度激活或抑制）即可造成神经元形态和功能的异常，影响神经网络的构建[1]N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂可引起不同脑区广泛的凋亡性神经元退行性变。***是NMDA受体非竟争性拮抗剂，临床常用于小儿麻醉。麻醉、手术对学习记忆的影响已有研究[2，3]，但在发育早期***麻醉是否对空间辨别性学习记忆有远期影响还鲜见报到。本研究采用神经功能学和**组织化学的方法拟观察新生大鼠***麻醉后空间辨别学习能力和海马突触素的变化，为***的合理应用提供实验依据。。脑爆发生长期应用改变神经元生理活性的
1材料与方法
1.1动物及麻醉处理 新生1周Wister大鼠30只，体重18～20g，由西安第四军医大学实验动物中心提供。随机均分为三组，每组10只。生理盐水组（N组）：给予与***同体积生理盐水；K100组和K50组麻醉诱导时分别腹腔注射***100mg/kg和50mg/kg，以后每小时追加首剂量的1/2，维持麻醉6h。大鼠平卧在自制的麻醉箱中实施麻醉，同时用婴儿脉搏血氧饱和度探头贴于小鼠腹部，监测Sp02和HR，以防止麻醉过深所致大鼠脑缺氧，采集尾部血，用i-STAT型血气分析仪（雅培公司，美国）行血气分析均正常（距幼鼠尾3mm处剪断鼠尾采血）。幼鼠麻醉结束后与母鼠同窝饲养。
1.2认知功能测试方法
1.21旷场实验 旷场行为观察箱为60cm×60cm×60cm的无顶木箱,箱底用墨线分为36个等份小方格。麻醉后3周大鼠自中央格放入，观察在中央格停留时间和2min内穿越的格子数。
1.22Morris水迷宫实验 morris水迷宫为一直径1.2ｍ、高0.5ｍ圆桶，划为四个象限，盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水温控制于22～25℃。将一直径10cm平台固定于某一象限，平台在水平面下1cm。麻醉后16d开始水迷宫试验。程序包括①定位航行试验历时5d，每天上下午各4次，将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中，记录2min内寻找平台的时间(逃避潜伏期)；②空间探索试验，将鼠任选一入水点放入水中，测其2min内在原平台处停留时间。整个认知功能测试过程中，保持实验室内灯光、物品摆放等室内环境一致，以排除环境干扰。
1.3海马突触素检测方法
1.31动物取材 认知功能测试完毕后立即将大鼠开胸，经左心室至升主动脉插管，先以100ml生理盐水冲洗血液，随后用冷的（4℃）含40g/L多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）先快后慢灌流固定2h，取脑置于300g/L蔗糖中（4℃）直至组织沉底，冰冻切片机连续冠状切片，片厚30μm，切片分套，置于0.01MPBS中存放。
1.32**染色 取1套切片在0.01M PBS中漂洗后，入含0.3%Triton X-100的0.01MPBS中浸泡30min（室温）。然后进行**组织化学荧光染色：加入突触素I抗（1：500，Santa Cruz公司 美国）孵育24h（室温，在湿盒内）。在0.01MPBS液中漂洗3次，每次5min。加入荧光II抗（1：200，Chemicon公司 美国）闭光孵育2h.室温避光孵育2h。0.01 mol/L PBS洗3次，80%甘油封片，Confocal共聚焦显微镜下观察并采集图象, 用Image J 图象处理软件（NIMH公司，美国）进行分析，以荧光半定量OD值来表示突触素的表达水平。
1.4统计学分析 定量数据以均数±标准差（）表示。采用SPSS10.0统计软件进行多组均数比较的方差分析及均数间的两两比较,用t检验，P≤0.05为差异有显著性统计学意义。
2结 果
2.1***麻醉对新生大鼠神经行为学的影响 各组大鼠在旷场中央格的停留时间及穿越的方格数无显著差异（P>0.05）。 水迷宫测试K100和K50组的逃逸潜伏期均明显高于N组（P<0.05），寻找到平台的时间较长，经训练提高较慢。探索时间K100和K50组短于N组（P<0.05），大鼠常在四个象限无目的漫游。K100组和K50组之间差异无显著意义（表1）。
2.2***麻醉对新生大鼠海马SYN表达的影响 本实验显示: 正常状态下,SYN在海马CA1、、CA2和CA3区呈现绿色荧光，N组的绿色荧光强度较弱，K100组和K50组的荧光强度较N组强，它们的OD值见（表1）。
3讨 论
突触素是一种相对分子量为38×103 的钙结合糖蛋白,特异性位于轴突终末端的突触前囊泡膜上,是一种重要的囊泡膜标志蛋白[4]。突触素参与乙酰胆碱、谷氨酸等神经递质的释放过程, 与突触可塑性关系密切。突触可塑性是突触对内外环境变化作出反应的能力，是学习记忆的神经生物学基础[5]。研究认为，突触素一方面通过对突触结构的影响，另一方面通过其磷酸化作用调节神经递质的释放，从而在突触可塑性中起一定作用。突触素影响突触可塑性的观点，已为大多数学者所接受，但是Spillance 等[6]采用突触素基因敲除的小鼠却发现，突触素对于海马两种不同形式的长时程增强(Long-time potention,LTP)的诱导或表达和由蛋白激酶激活而引起的神经递质释放的增加都不是必需的，认为突触素并不是长时程增强的必需成分，morris水迷宫而LTP介导了突触可塑性的发生，与学习记忆密切相关，Rosahl等[7]研究也认为突触素并不是神经突起长出、突触发生和突触囊泡交换所必需的。多种影响学习记忆功能的因素可能与突触素及其磷酸化水平的改变密切相关。但突触素作用的机制仍存在一些争议，有待进一步深入研究。
Morris水迷宫是一种研究与海马功能直接相关的空间学习记忆模型。逃逸潜伏期表明获取空间信息的能力，而探索时间表明记忆储存及提取再现能力。本研究结果表明,***麻醉新生1周大鼠（麻醉大鼠所需***的浓度为50mg/kg～100mg/kg），在麻醉后3周观察到麻醉大鼠水迷宫逃逸潜伏期延长，探索时间缩短，提示麻醉大鼠与未麻醉大鼠的空间辨别学习和记忆能力出现下降。**组织化学表明***可上调海马突触素表达，.而Calhoun等[8]研究却发现，老年大鼠海马齿状回区突触颗粒数量与大鼠在水迷宫的作业成绩有显著相关性。用人参皂甙对大鼠行腹腔注射，可使其海马突触素表达增强，在Morris水迷宫中的空间学习能力提高9]。这些研究均提示学习记忆与突触素的含量呈正相关性，而在本试研条件下却发现，突触素表达上调，而大鼠认知功能却降低，与以往的研究结果相矛盾，因此，本研究认为，***导致大鼠认知功能下降的主要因素:（1）神经元大量凋亡,既往研究表明，在哺乳类神经突触发生的关键期（大鼠生后2周内），注射NMDA受体拮抗剂AP5和MK-801可导致神经细胞出现异常轴突侧枝以及广泛的神经变性、凋亡10]。猴如果在出生后2周内阻断NMDA受体，可出现大量凋亡性神经降解[11]。（2）NMDA受体表达增强。NMDA受体是离子型谷氨酸受体的一种。原位杂交证实NMDA受体阻断剂MK-801和***增加新生大鼠NR1/NR2A、抑制NR1/NR2B的重组表达，引起受体结构的变化。同时，本试研室研究还发现，***可上调海马NMDAR2及谷氨酸转运体(GLAST)表达[12]，而NMDA受体的上调表达能导致神经兴奋性毒性增加，从而影响其学习记忆功能。由于突触素通过其磷酸化作用调节神经递质的释放，相反NMDAR2表达上调是否可引起突触素表达上调，这种猜测将是我们下一步研究方向。
综上所述，***可降低新生大鼠认知功能，并上调海马突触素的表达。
更多实验方法请参考博客：blog.sina.com.cn/softmaze和公司网站：www.softmaze.com。
