旷场实验箱、Morris水迷宫注意缺陷多动障碍大鼠模型的建造
【实验目的】:探讨旷场实验箱、Morris水迷宫注意缺陷多动障碍大鼠模型的建造技术。
【方法】:将20只4周龄SD大鼠随机分成模型组和对照组,模型组自由饮用0.2 mg/mL醋酸铅溶液。28 d后运用开场实验、Morris水迷宫、Lat迷宫观察两组大鼠行为学表现;采用ICP一MS检测大鼠血铅浓度、酶联**吸附测定法法(ELISA)测定大鼠血清中多巴胺和去甲肾上腺素含量。
【结果】:模型组在开场实验中大鼠穿越格子数、直立次数增多(P < 0. 05 ) ,Lat迷宫中直立次数及穿越角落的时间比例增加(P< 0. ,05),Morris水迷宫口标象限停留时间缩短(P <0.05);模型组大鼠血铅浓度高于对照组(P < 0. 05 ) ,血清多巴胺和去甲肾上腺素含量低于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。
【结论】:采用自由饮用0. 2 mg/mL醋酸铅溶液法成功建造了ADHD大鼠模型,具有ADHD基本临床特征,可做为ADHD的动物模型进行实验研究。
【关键词】:注意缺陷多动障碍模型;醋酸铅;SD大鼠;行为学检测;多巴胺;去甲肾上腺素
儿童注意缺陷多动障碍(ADHD)简称儿童多动症,在儿童青少年精神心理**中具有代表性,其主要表现为自主活动增多、学习记忆能力下降、注意力不集中等。ADHD的病因和发病机制尚不确定,目前认为本病是由多种生物因素、心理和社会因素所致的一种综合征。在ADHD的病因学调查中,外部环境因素对其影响占有绝大部分,特别是**生活环境和有害物质的暴露,对正处于成长发育关键时期的青少年有巨大的影响。本文以少量铅暴露建造ADHD大鼠模型,并从行为学和生化学两个方而对其进行评估。
【1材料与方法】
1. 1实验动物与分组20只SD大鼠,4周龄,雄性,SPF级(北京大学医学部实验动物科学部),许可证号:SCXK(京)2011一0012。实验室适应3d后,随机分为A,B两组(即模型组和对照组)。5只/笼(鼠笼25 cm x 45 cm x15 om),明暗交替比12: 12 h (7: 00一19 : 00),室温2022 0C ,湿度适宜,大鼠自由进食和饮水。
1. 2实验方法
1. 2. 1大鼠模型建造采用0. 2 mg/mL的醋酸铅溶液自由饮用法建造模型,对照组自由饮用蒸馏水,余其同。
1.2.2行为学检测
1. 2. 2. 1开场实验:开场实验视频分析系统及开场实验箱由上海欣软信息科技有限公司提供。开场实验箱由医用有机板制成,规格为50 cm X 50 cm X 50 cm,采用九宫格为测试基底。测试前1d将大鼠放入开场箱10 min适应环境,以减少大鼠对陌生环境产生的焦虑而影响其活动水平,实验开始时将大鼠轻轻放入中央格子,在光亮条件下,通过视频分析系统自动记录大鼠5 min内的活动情况,记录大鼠穿越的格子数、直立次数、理毛次数以及粪便数。测试期间保持周边光线和噪声的一致性。
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1.2.2.2 Morris水迷宫测试:Morris水迷宫视频分析系统由上海欣软信息科技有限公司提供,Morri s水迷宫箱体(箱体由直径155 cm,高50 cm灰白色铁皮圆形蓄水池及同颜色平台构成),池内水深25 cm,水温22-24 0C。将水池平均分为一、二、三、四四个象限,平台顶端平面面积为8 cm X 8 cm,训练期间迷宫外参照物的位置保持不变。将大鼠置于一个象限内,距圆心21 cm,距池壁20 cm,隐没于水而下1.5 cm(训练期间平台位置不变)。第1d不设立平台,让大鼠进入水池自由游60 s进行适应性训练。从第2d开始连续Sd随机地从四个不同象限让大鼠进入水中,大鼠入水寻找并逃避到平台。
视频分析软件记录大鼠从入水到找到平台所需时间(潜伏期),若在120 s内大鼠无法找到平台,则由检测者引导其上平台。所有大鼠上台后均停留10 s,以利于其对空间参照物的记忆。第6d去掉平台,让大鼠在水中游泳120 s,记录大鼠穿越原平台所在位置的次数、在原来平台所在象限所停留的时间及路程,以此评价动物对己获取信息的存储、记忆能力。
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1. 2. 2. 3 Lat迷宫:Lat迷宫实验箱为一个40 cm x 60 cm x 60 cm的木箱,中间放置一个30 cmx 30 cm的透明有机玻璃箱,从而产生一个宽15 cm、长60 cm、高40 cm的通道,根据视频分析软件分析记录观察大鼠穿越角落的时间和直立次数,作为对环境刺激的非选择性注意水平的评价指标。
1.2.3生化指标测定
1. 2. 3. 1血铅浓度的测定3. 0%****钠腹腔注射麻醉大E (40 mg/kg),腹主动脉采l(TL 2. 5 mL于肝素抗凝管中待查;取2 mL全血于消解罐中,加8 mL浓硝酸冷消化1 h,按优化程序进行微波消解,电热板160℃赶酸后,用2. 0 %硝酸定容到25 mL,摇匀待测。采用电感藕合等离子体质谱法(ICP一MS)测定全血中铅含量。
1.2.3.2血清中多巴胺和去甲肾上腺素含量测定3. 0%****钠腹腔注射麻醉大鼠(40 mg / kg)后,腹主动脉采血4 mL于非抗凝管中,静置3h,离心10 min (3 000rpm),取上清1 mL,分装到两个EP管中,于一80℃保存备用。大鼠血清中多巴胺和去甲肾上腺素含量测定:采用北京利维宁生物科技有限公司提供的大鼠多巴胺和去甲肾上腺素酶联**分析(ELISA)试剂盒。
1. 3统计方法采用SPSS 17. 0统计软件,进行两独立样本资料检验。
【2结果】
2. 1大鼠行为学指标检测
2.1.1开场实验结果比较模型组大鼠在开场试验中表现大鼠活动能力的穿越格子数、直立次数较对照组大鼠增多,差异具有统计学意义(P <0.05),而理毛次数和粪便数差异无统计学意义(P >0.05)。见表1
2.1.2 Morris水迷宫实验结果比较模型组与对照组大鼠在连续Sd的定位航行实验中找到平台的时间(潜伏期)随着实验的进行逐日递减,但是比较总体学习成绩在两组间差异没有统计学意义(P >0.05),见图1;在第6d的探索实验中,模型组大鼠穿越原平台所在位置的次数与对照组没有差异(P >0.05),但在目标象限停留的时间和游程比例较对照组大鼠缩短,差异具有统计学意义(P <0.05)。见表2
2. 1. 3 Lat迷宫实验结果比较在Lat迷宫中,模型组大鼠总的直立次数及穿越角落的时间比例都高于对照组,差异具有统计学意义(P <0.05)。见表3
2. 2生化学指标检测与对照组相比,模型组大鼠血铅浓度增加(P <0.05),且模型组大鼠血清中多巴胺和去甲肾上腺素的含量降低,差异有显著性(尸<0.05)。见表4。
3讨论
动物**模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验**学(包括新药筛选)研究。**的发**展十分复杂,以人本身作为实验对象探讨**发生机制,对推动医药学的发展来之缓慢,且临床经验的积累不仅在时间和空间上存在局限性,而且在道义和方法上也受到限
制。借助动物模型的间接研究,可以有意识地改变自然条件下不可能或不易排除的因素,更准确地观察结果,方便、有效地认识人类**的发**展规律,研究防治措施。
适宜的动物模型,有助于ADHD的临床干预**和实验室基础研究,阐明ADHD的发病机制和**的作用机理,同时也为ADHD**的预防干预探索新的思路。目前,关于ADHD动物模型的建立均以模仿ADHD的某一临床表现为主要依据,从遗传、神经发育及社会应激等多个层而建立模型。其中利用自然和人工培育的遗传突变体构建的SHR大鼠模型*为接近ADHD的表现,能够持续性的表达ADHD的一些基本特征,常被用于ADHD
的干预和**研究。其他的模型多是从ADHD的影响因素及发病机理来探讨并建立,如尼古丁ADHD模型、社会隔离ADHD模型、基因缺失ADHD模型等。理想的ADHD动物模型应该具有:(1)模拟ADHD基本的临床行为特征;(2)精神兴奋剂****有效;(3)吻合临床提出的一些合理的病理生理学假设;(4)对ADHD在行为、遗传、神经化学和**等方而研究提供预测作用;(5)能重复再现,操作简单,成功率高,能便于推广应用。
铅为环境中不可降解的有毒重金属,一直被认为是ADHD的环境影响因素之一,流行病学研究己经提供了有力证据表明即使在低浓度血铅水平,生命早期铅暴露会影响发育中的大脑。铅暴露的儿童成年后智力下降,表现出认知缺陷。
本次研究中,采用自由饮用0. 2 mg/mL醋酸铅溶液来复制大鼠ADHD模型,通过开场实验、Morris水迷宫、Lat迷宫等行为学检测,结合血铅浓度、血清多巴胺和去甲肾上腺素含量变化等生化学指标对对动物模型进行评估。结果显示:模型组大鼠血铅含量明显高于对照组,表明实验中铅染毒成功,是导致ADHD的**诱因。从行为学检测指标来看,模型组大鼠在开场实验中的直立次数、穿越格子数以及Lat迷宫实验中直立次数、穿越角落停留时间较对照组增加,表明ADHD模型大鼠自发活动水平以及非选择性注意水平增加,验证了铅暴露ADHD模型大鼠具备ADHD的多动和注意缺陷的临床特点;Morris水迷宫实验中模型大鼠在目标象限停留时间和游程所占时间比例较对照组大鼠明显缩短,提示ADHD模型大鼠的记忆能力减退,进一步验证了铅暴露ADHD模型大鼠具备ADHD的临床特点,该结论与Clements KM等的研究结果一致。由于ADHD的发病与神经递质密切相关,因此我们进一步检测了大鼠的血清中多巴胺和去甲肾上腺素含量,ADHD模型大鼠的血清中多巴胺和去甲肾上腺素含量明显低于对照组,表明铅可降低体内多巴胺和去甲肾上腺素水平,使得该模型更具ADHD的临床特征。
本次实验采用4周龄的SD大鼠作为实验动物,是由于4周龄的大鼠相当于人类的儿童期,而大鼠的神经系统与近似于人类,常被用做实验室研究。采用自由饮用0.2 mg/mL醋酸铅溶液来进行大鼠铅染毒法制备ADHD模型,在一定程度上模拟儿童铅污染过程。可见本实验的拟ADHD大鼠模型建造成功,为今后儿童注意缺陷多动障碍的防治干预研究奠定了良好的实验基础。