不同性别条件恐惧大鼠模型的行为比较

不同性别条件恐惧大鼠模型的行为比较

【摘要】  目的  探讨不同性别条件恐惧大鼠的恐惧记忆保持和矿场行为是否存在差异。方法　利用巴甫洛夫经典条件反射建立声音+电击,建立条件恐惧大鼠模型，于训练前1天及训练后第1、3、7、20天进行恐惧记忆保持测和试旷场测试。结果　(1)恐惧记忆保持测试实验结果显示,雄性大鼠的恐惧记忆保持水平高于雌性大鼠，其僵立时间百分比在个时段均高于雌性大鼠，尤其在训练后训练后1天和训练后20天，雄性性大鼠为67.90±34.74与 27.4±22.51，雌性大鼠为23.60±21.10和3.10±3.07,存在统计学差异（P<0.05）。（2）旷场实验结果显示,除修饰次数外，雌雄大鼠旷场行为比较存在明显统计学差异（P<0.05）。结论　雌雄条件恐惧大鼠存在行为学差异。  
【关键词】  应激　恐惧记忆保持　旷场行为   
        创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder,PTSD）是指在强烈的精神创伤后发生的一系列心理、生理的应激反应所表现出的一系列临床综合征。  
        PTSD临床表现多样，从临床症状来看,其核心症状是创伤性记忆的不断闯入导致恐惧情绪、逃避行为和过度唤起的生理反应。有研究表明,社区普通人群中PTSD的终生患病率男性为5%,女性为10.4% 。普通人群中女性的患病率是男性的2倍。制备理想的模型是研究PTSD发生、发展规律机制的一个重要环节。目前PTSD的动物模型，多采用条件恐惧模型。一般认为，雌性动物由于生理周期的影响，在PTSD的动物实验研究中，制备动物模型多采用雄性动物，那么动物雌雄间是否具有差异，未见报道。本研究中依照文献所用的方法[3]，建立条件恐惧大鼠模型，观察雌雄大鼠条件恐惧记忆保持及其行为活动的差异。  
        1　材料和方法   
        1.1实验动物与材料  
        健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，雌雄各10只,体重200±30g,由第三军医大学实验动物中心提供。自制足底电刺激控制箱，该装置由电刺激箱、电压控制仪一季声音发生器组成。旷场行为观察箱为90m×90m×45cm铁皮箱,底被划分为等面积的25格正方形方格。  
        1.2实验方法  
        1.2.1条件恐惧大鼠模型制备  
        先将大鼠在动物饲养室中适应1周,室温22～25 ℃, 分隔喂养, 自然昼夜节律光照,通风良好, 自由摄食、饮水。期间实验者每天抚摸大鼠5分钟以使动物适应。并将大鼠放入电击箱内10分钟，使其熟悉电击箱并观察大鼠行为。模型制备前**，进行一次旷场测试。所有的行为实验均在8:00AM- 12:30AM间进行。  
        采取声音信号提示结合电击大鼠足底产生条件性恐惧的方法,制造创伤后应激障碍动物模型。将大鼠放入电击箱中，适应3分钟允许自由探索，3分钟之后由扬声器输出声音信号（4.5kHz,80db；条件性刺激，conditioned stimulus CS）；持续30秒，在30秒声音*后两秒同时加以不可逃避的足底电刺激(40V～45V，10秒；非条件性刺激，unconditioned stimulus, US )，反复10次，两次间隔1～4分钟。当给予声音信号，动物出现显著僵立行为或逃避反应，表示声音信号提示的恐惧性条件反射建立。电刺激结束后动物继续在该箱中停留1～4分钟然后放回日常饲养笼中。每只大鼠训练结束取出后及时地清理其排泄物，将电击箱打扫干净，并用90%酒精檫洗箱底。  
        1.2.2 行为学测定  
        1.2.2.1恐惧记忆保持测验  
        主要测定僵立行为（僵立行为是一种普遍见于啮齿类的防御行为，表现为刻板式的蹲伏姿势，大鼠外观除呼吸运动以外其余的肌肉运动均消失，是大鼠恐惧表达的行为方式。于训练后第1、3、7天和训练后20天时观察两组大鼠情感行为改变，将大鼠放入电击箱中，适应3分钟允许自由探索。然后，只予以声音刺激而无电击,其他条件同模型制作时，观察3分钟内大鼠僵立时间，僵立时间之和占总时间的百分比即为僵立时间百分比。间隔0.5-1min 后，重复上操作，连续5次。  不同性别条件恐惧大鼠模型的行为比较
        1.2.2.2旷场实验(Open-field test )  
        于训练前1天及于训练后第1、3、7天和训练后20天时各组大鼠进行旷场实验，实验在安静、光线较暗的环境中进行, 将大鼠轻轻放入旷场行为观察箱中央小方格内，观察3min内大鼠的情感行为情况:①大鼠运动活性：穿行格数, 指三爪以上跨入邻格的次数；②探究行为: 直立次数,指两前爪腾空1cm 以上或攀附墙壁次数；   
        1.3数据处理  
        采用SPSS13.0统计软件进行分析，所有数据均由（x-±s）表示，进行t检验确定组间差异，检验结果以P <0.05为差异有统计学意义。  
        2　结果  
        2.1恐惧记忆保持测验结果  
        大鼠在重新置入电击箱中呈明显僵立行为。雄性大鼠在不同的时间点僵立时间百分比均明显高于雌性大鼠。尤其在训练后训练后1天和训练后20天差异具统计学意义，结果见表1。  
        表1  条件恐惧大鼠模型恐惧记忆保持测试僵立百分比()  
        与雌性比较  * P<0.05  
        2.2旷场实验测定结果  
        表2 -表3可见，在旷场实验中，经前后对比，大鼠直立次数减少( P<0.05)，粪便粒数增加( P<0.05)。雌性大鼠穿行格数也减少、而雌性大鼠格数先增加然后呈波动性减少。雌雄两组间在再次穿行格数、直立次数，雌性大鼠明显高于雄性，单因素方差分析显示雌雄两组间旷场测定结果不同的时间点也存在显著差异。  
        表2  条件恐惧大鼠模型旷场实验穿行格数() 
        与雌性比较  * P<0.05  
       表3  条件恐惧大鼠模型旷场实验直立次数() 
        3　讨论  
        文献显示，通过条件反射性恐惧训练建立恐惧记忆模型，应激相关的创伤事件刺激可以触发恐惧性记忆的提取，提高动物警觉性和回避反应。     
        一方面,从以前PTSD动物实验研究来看,一般认为对啮齿类动物而言, 僵立行为是动物在面临负性相关刺激无法避免时的一种防御反应，被认为是一种反映恐惧的可靠指标。从表1中可知,本研究的大鼠经条件恐惧训练以后，不同时间点进行恐惧记忆保持测验,动物的僵立时间百分比基本增加，这可以说明本实验动物模型对条件刺激尤其是雄性大鼠获得了恐惧记忆并长期保持，模型较好地模拟了PTSD的核心症状—病理性恐惧记忆增强。在本实验中，动物的僵立时间百分比随着时间的增加总体呈下降趋势，说明条件恐惧记忆随时间增加会逐渐消退，而恐惧保持测试,既可唤起恐惧记忆促进恐惧记忆再巩固同时也可以促进条件恐惧记忆消退。但雌雄大鼠之间相比较，在不同的时间点雄性僵立时间百分比均明显高于雌性，这也许可以解释成同样的创伤性刺激在动物中，雌性可能更能耐受，恐惧程度较雄性低，创伤性记忆较容易消退。  
        Hall(1934)首先将旷场反应作为动物恐惧、紧张情绪的重要指标。旷场行为分析主要反映动物对新环境的探索、习惯以及伴随的情绪变化，跨格次数及直立次数是动物探索行为及兴奋性的反映。目前有一些研究结果发现，动物在因应激而产生紧张、恐惧（情绪性）时会发生走格减少，僵立、卷缩等现象。从表2看，两组动物跨格次数及直立次数随实验天数的增加总体上基本呈逐渐降低并且都较处理前显著减少，表明动物对新环境逐渐熟悉，但雌性大鼠各时间点的跨格次数及直立次数均高于雄性大鼠，雄性大鼠的兴奋性较雌性大鼠低，对环境的适应性相对变差。  
        本实验仅就不同时间条件恐惧雌雄大鼠恐惧记忆保持及其旷场行为活动的差异作了初步比较,声音+电击制备的大鼠条件恐惧大鼠模型，均有显著的行���异常，且异常程度在雌雄大鼠之间存在差异。