仪器科普丨实验动物手术基本操作

  一、手术环境：

       手术室温度控制在20-25℃，气温较低时可使用加热装置来保证实验动物在手术中的体温维持在正常范围，电热丝加热垫会产生较大干扰噪音，在采集信号时应将其关掉。整个操作环境尽量保持无菌状态（可在无菌操作台中进行）。

 二、主要实验器材：

       止血钳、镊子、手术剪刀（大剪刀及小剪刀）、缝合针线、手术刀柄和刀片、颅骨钻及钻头（0.8mm）、螺丝刀、电动剃、注射器等，所有的手术器械在使用前均需经过严格**处理。

 三、主要材料及药品试剂：

       无菌生理盐水、75%医用酒精、碘伏、酒精棉及棉签、脱毛膏、不锈钢微型螺丝钉（M1*2、M1*3，使用前应使用75%酒精充分浸泡清洗），牙科水泥粉、戊*巴*比*妥钠溶液（1%，现配）、红霉素眼膏、利多卡因膏、三联***、阿托品（1mg/mL）、地塞米松、卡洛芬等。

  四、手术操作步骤

       以实验用大鼠为例。

       将大小约20*20*20cm的盒子置于电子秤上，去皮，把大鼠放置在盒子内（抓大鼠时需戴上防咬手套），读数。

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       麻醉对整个手术至关重要，其麻醉的稳定性直接影响到手术结果的好坏。若要获得更好的麻醉效果，建议使用异氟烷呼吸麻醉，但由于呼吸麻醉成本较高且麻烦，多数实验室还是使用注射麻醉，因此这里以注射麻醉为例。

       麻醉剂采用1%戊*巴*比*妥钠溶液（戊*巴*比*妥钠比水合氯醛麻醉更稳定，但容易产痰，咯痰时及时使用吸管吸出），剂量为0.5ml/100g（50mg/Kg）。腹腔注射前先对大鼠用异氟烷短暂麻醉，具体操作：将大鼠放进透明盒子中，此时将蘸有异氟烷的棉球丢入盒子内，密封，待大鼠安静不动，呼吸均匀（1次/秒）时取出。腹腔注射：将大鼠仰面朝向，提起一侧后肢，在大腿根与腹中线的中间位置刺入皮下，在皮下平行于腹中线推进针头3-5mm，再以45°角向腹腔内刺入，针尖通过腹肌后，无阻力，回抽无回流物，缓慢注入麻药。

       注射麻药后，对大鼠进行疼痛反射（掐尾端或后脚掌）和眼角膜反射来判断麻醉效果。在15min之后还未能完全麻醉的大鼠可适当补加0.2-0.5ml的1%戊*巴*比*妥钠溶液。若手术时间较长，应每隔1h检查大鼠麻醉状态，当出现疼痛反应时，应补加0.5ml的1%戊*巴*比*妥钠溶液。手术中，应将大鼠舌头从口的一侧拉出，为防止大鼠在麻醉过程中呼吸道出现过多分泌物导致窒息，可在麻醉过程中注射0.5ml阿托品（1mg/ml）。

       用左手将麻醉后的大鼠托住，右手手持电动剃逆着大鼠毛发的方向（从后往前）将头顶的毛发剃除，一般剃毛范围是两耳之间，前至两眼间，后至颈部始端。若要达到更好的干净度，可涂抹少量脱毛膏，使用后需要使用生理盐水清洗掉残余物。

       大鼠固定的好坏会直接影响到手术中信号采集的稳定性，甚至会影响到慢性植入后的效果。

首先将一侧耳杆固定，找到大鼠耳道稍向前上方的骨性凹陷处（可以用手触摸到），将其中一侧的凹陷处贴在固定的耳杆上（提前涂抹少量利多卡因药膏可以避免耳杆对大鼠刺激），此时将另一侧耳杆也插入对应的位置，调节两侧耳杆长度，使之对称，固定紧耳杆。左右及上下轻轻移动大鼠的头部，避免出现松动及偏斜。

       在固定好大鼠耳杆后，还需将大鼠的上门齿固定。具体操作：将大鼠上门齿卡进门齿杆的槽内，下颌处于门齿杆的下方，然后下调两侧的眼眶固定杆，压紧并固定。适当调整各固定点，使得大鼠的整个颅骨面保持水平，从各个方向用力均不能移动大鼠的头部。

       *后在大鼠的眼部涂抹上红霉素眼膏或甘油，以防止手术灯的长时间照射造成眼部损伤以及保持眼睛的湿润。另外，要用圆头镊子将大鼠的舌头从口中一侧拉出，防止手术中出现窒息。

       按照75%的酒精、碘酒、75%酒精的顺序清理待手术开口处。

       使用大手术剪刀将皮肤剪开，开口的大小由手术的植入部位及目的来决定。如若对大鼠只进行一次急性记录（术后电极取出，大鼠留待他用），可以只将大鼠颅骨上方的皮肤沿着矢状缝剪开，后起后脑，前至前脑，使用止血钳将两侧皮肤撑开。若做电极长期植入记录，可直接将颅骨上方的皮肤剪去，剪掉的面积不宜过大，可借助止血钳将开口适当撑开。

       使用小剪刀将颅骨上的粘膜剪去，用棉签不断地稍用力摩擦颅骨表面，充分暴露出硬性骨质层，此时可以使用利器轻轻涂刮，使得颅骨表面粗糙以便于牙科水泥的粘连固定，中间适当使用医用棉球擦去血迹及其他残留物。注意：不建议用双氧水擦拭，刺激性太强，会影响动物神经元放电。

       颅骨表面充分晾干后会显现出明显的矢状缝（中轴线）、前囟Bregma、后囟Lambda，若记录部位较小或较深，要求定位精度较高，此时还需对大鼠固定的准确度进行校准。具体操作：在定位仪上方的夹持器上固定一根细棒，将细棒的**移动到矢状缝的前端，往后慢慢移动，若细棒顶端在移动过程中一直在矢状缝上，且前后距颅骨面高度相近，证明大鼠的头部固定符合定位要求，否则再进行相应的调整。

       以前卤中心为原点，根据大鼠脑区立体图谱（Paxinos& Watson，第六版）计算所需植入电极位置的坐标，不同大小的大鼠定位应按照标准图谱进行比例换算，另外开口形状尽量与电极阵列形状类似，而面积要稍大于电极阵列的横截面，在拟开口处做上标记。

       将颅骨钻调至适合转速，并调对正确转向。在非植入区钻出3-5个孔作为颅钉的固定位置，这些位置点尽量均匀分散在颅骨的非植入区（若做急性记录，此步骤省略）。在钻孔的过程中，应一手持电钻，另手作为支托，使得钻头的力量尽量平稳，通过间断性的提起钻头可以减少局部高温，而且这样更容易感知到钻头的实际压力，避免用力过猛。在下钻过程中突然出现悬空感时即可停止，将周围擦净后就可拧入螺丝钉。在拧螺丝钉时力量不宜过大，且应连续旋转螺丝刀，以避免滑丝。在螺丝钉刚刚穿过颅骨后，但还未挤压到颅内脑膜时就可停止（约0.6-1mm，要结合具体大鼠体型）。

       在植入位置的标记线上进行打磨开颅，在打磨过程中应将钻头来回地更换位置，以避免产生局部高温损伤脑组织。在往下打磨中先不要急于钻透，留下较薄的一层（按压开口处的颅骨松动无较大阻力），此时将打磨后的颅骨从一侧钩起（可以使用折弯**的注射器针头，如图5），利用细镊子从钩起的位置将其夹去。*后在颅窗开口处放置一个医用棉球，上面用生理盐水浸湿，用于压迫止血。颅窗面积大小要稍大于电极阵列的横截面积（考虑植入中要避开边缘部分残存的颅骨）。

       这一步只针对一部分特制细丝多阵列电极，其他大部分电极可直接穿透硬脑膜。利用**折弯的注射器针头（图5）在无血管的地方将硬脑膜小心挑破，钩起一侧，利用镊子将硬脑膜轻轻揭去。在挑、钩硬脑膜的过程中一定要避开****，因为血管的破坏会在一定程度上影响到此区域神经元的活性，而且出血过多会影响手术植入。*后，在去掉硬脑膜后应滴加脑缓冲液(Cortex Buffer)，以维持正常的脑组织环境。

       将电极基座小心地固定在定位仪上的夹持器上，调整角度，使电极丝的方向与颅骨平面垂直（尽量90°）植入越深，垂直度要求越高，否则植入会有误差），将其与信号采集系统的输入端相连，缓慢地将电极靠近颅窗中心，将电极上的地线紧紧缠绕在附近的螺丝钉上，若是要进行慢性实验，为获得更好的导电效果可以提前把螺丝钉焊接在地线上，*终固定在颅骨上。在电极丝触碰到皮层表面时记为深度值的0点，*终缓慢地下降到记录区域的位置。若是在手术中需要长时间的信号采集，可以在颅窗开口滴一滴矿物油，以避免脑组织内水分的挥发。

       利用医用棉球将颅骨面清理干净并保持干燥，调制出较稀的牙科水泥，使其自然流进电极阵列的缝隙中，外围涂上较稠的牙科水泥进行固定，在这个过程中尽量避免牙科水泥与皮肤开口及粘膜的接触，因为牙科水的刺激性可能会导致大鼠的抖动。在对电极简单的固定后可以小心地去掉电极的连线及夹持器，*终将整个暴露出的颅骨连同螺丝钉、地线都使用牙科水泥封住。

       在大鼠头部手术开口及周围使用碘伏擦拭并涂抹适量的三联***，也可注射适量的地塞米松以预防术后炎症，另外，皮下注射适量的卡洛芬可以减小术后疼痛。*后，将大鼠从定位仪上取出，置于加热垫上恢复，直至麻*醉*药效消失，可以自主活动，方可放于新的鼠笼内单独饲养。

手术后三天应每天察看手术后大鼠的状况，定期进行**处理，包括伤口涂抹***，以及注射卡洛芬。

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