⑴在仪器使用前，首先连接好所需配套仪器：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、记录仪(色谱工作站)。将各类插头与插座接妥(220V电源)。
⑵按下检测仪ON电源开关，电源指示灯亮，说明整台仪器电源开始工作，然后观察光源指示灯，如果亮了，表示光源已开始工作，整台仪器可进入工作状态，将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拨到100%T档(仪器预热20分钟，待基线平直后可加样测试)。
⑶接通记录仪电源开关，使电源开关拨到“通”指示灯亮。可根据记录仪说明书调换不同的纸速度，用户根据需要自行掌握，测量用10mV档。此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节检测仪“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。。
⑷把检测分析仪器进样口聚乙烯塑料管接到恒流泵上，使凝胶层析柱中缓冲液流过检测仪(恒流泵流量视凝胶层析柱大小选1-3ml/min)。用“调零”调整吸光度A值为0(量程开关拨到100%T调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拨到“0.05A”档，缓慢调节A调零旋钮，使记录仪指示在“O”位，检测仪显示为“O”)。
⑸以上步骤结束，析系统平衡后即可用洗脱液开始洗脱样品，洗脱前再调一次吸光度0点。洗脱过程结束前不可再调节“调零”旋钮。当洗脱液流过检测仪时，吸光度显示大于零的数值，吸光度数值大小随样品的浓度而变化。洗脱完毕后吸光度显示为稍大于零的数值。
⑹数字显示吸光度和记录仪自动绘制吸光度图谱是两个互相独立的检测系统，数字显示吸光度与记录仪所绘峰值大小没有直接关系，不可互相换算。
⑺测试完毕后，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和聚乙烯塑料管。
注1：记录仪光吸收A读数
当采用10mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0—0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。
注2：数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0—1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。
当A量程开关切换在其他量程位置时，则数显光吸收A读数为：
①A量程选定在0—2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A
②A量程选定在0—1.0档时，数显读数×1=实际光吸收读数A(即直接读数)
③A量程选定在0—0.5档时，数显读数×1/2=实际光吸收读数A
④A量程选定在0—0.2档时，数显读数×1/5=实际光吸收读数A
⑤A量程选定在0—0.1档时，数显读数×1/10=实际光吸收读数A
⑥A量程选定在0—0.05档时，数显读数×1/20=实际光吸收读数A
⑦A量程选定在0—0.02档时，数显读数×1/50=实际光吸收读数A
注3：当显示模式开关选定固定量程读数时，数字显示板上的读数为实际光吸收A读数，该读数将不随A量程开关的切换而改变。(此时切换A量程开关，只改变记录仪输出的灵敏度，而不影响读数和积分仪信号输出，该功能指HD-21C-B型)
注4：HD-21C-B型紫外检测仪可同时进行记录仪和积分仪信号输出。积分信号输出为0.1A/mV,测定灵敏度可由计算机软件设定。