6-荧光素亚磷酰胺单体

　　经典的oligo合成是从3'端到5'端，因此在5'端连接染料是明智选择。修饰5'端的试剂通常与oligo5'端的羟基反应。因此Dye单体是常用的5'端标记试剂，在DNA合成中不需要改变操作步骤。通常荧光标记的oligo是用浓氨水脱保护的。FAM, JOE, Dabcyl, TQ 或 BHQ-labeled oligos可以加热到55°C 在氨水中脱保护，但是TET 和 Cy3 标记的oligo不太稳定，只能在55°C稳定几个小时。HEX 和 Cy5 只能在常温中脱保护，并且参与的氨水必须马上洗掉。

　　荧光素标记: 这些荧光素单体不含有4,4’-dimethoxytrityl (DMT) 基团，一旦它们在5’端标记就封端了。

　　罗丹明标记: TAMRA具有吸光的性质，它的光谱与几类常用的荧光化合物重叠，例如：FAM, HEX, TET 和 JOE, 在双标的FRET探针中是个很好的受体，TAMRA 已经广泛用于荧光定量PCR，和其它分子诊断试剂。TAMRA 标记Oligo可以有两种方法。在标准的脱保护的情况下TAMRA明显不稳定的，它在氨水中降解。如果需要标准的脱保护方法oligo首先在3’端 或5’端标上氨基，然后用TAMRA, SE标记。TAMRA也可以直接标记 Oligo，可以用TAMRA-dT-CE phosphoramidite 取代其中的 dT，或者在3’端用3’端TAMRA CPG 。随后oligo 的脱保护可以用碳酸钾的甲醇溶液脱保护，也可以用 1:1:2 t-butylamine/methanol/water 来脱保护。

　　淬灭基团的标记: 淬灭基团可以吸收紫外光但是不发荧光，通过FRET用来构建TAQMAN探针。常用的淬灭基团有Dabcyl, BHQ, TQ, TAMRA等。.

　　下面以6-FAM亚磷酰胺单体来介绍5’端标记Oligo的操作步骤。

　　6-FAM phosphoramidite

　　CAS#：204697-37-0

　　中文名：6-FAM 亚磷酰胺单体

　　分子式：C₄₆H₅₈N₃O₁₀P

　　分子量：843.94

　　将 6-FAM phosphoramidite 连接到Oligo

　　1. 用干燥的乙腈溶解6-FAM phosphoramidite(乙腈中水的含量< 30ppm)。

　　2. 在PE™ 8900 这台仪器上，加2mL 乙腈到0.1g 6-FAM phosphoramidite中，得到的浓度为50mg/mL。在 PE 390系列仪器上，加 1.2mL乙腈 到0.1g 6-FAM phosphoramidite 得到 0.1M 的溶液。

　　3. 轻轻晃动小瓶，直到固体粉末完全溶解。然后放在DNA合成仪上，可以使用三天。

　　4. 输入Oligo的合成序列，6-FAM phosphoramidite标记在 5’端，标记时间至少是3分钟。

　　5. 标准的DNA oligo合成操作。6-FAM phosphoramidite不含有DMT基团，只能在*后一步标记在5’端终止反应。

　　6. 用氨水在55°C ，8小时对oligo进行脱保护。

　　7. 已标记的oligo可以进一步处理，例如脱盐，用HPLC或者 PAGE纯化。纯化过程中FAM标记的oligo因为有颜色所以非常容易收集。

　　8. 标记的Oligo要避光保存。

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