注意事项:
1、使用前请将适量乙醇加入DNA Wash Buffer,令乙醇终浓度为80%;
2、纯化中低拷贝的质粒时,使用2倍的菌液体积,2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同体积的Wash Buffer和Elution Buffer;
3、若为-70oC甘油冻存的菌,请先涂布平板培养后,再重新挑选新的单个菌落进行培养。
质粒小量提取试剂盒操作简要步骤:
1、接种新鲜的单个菌落到1-4 mL的LB培养基(含适量***),37oC震荡培养14-16小时。室温下10,000 x g离心1分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。
2、 加入250 µL Buffer A1(确保已加入RNase A),用移液枪或涡流震荡充分悬浮**细胞。
3、加入 250 µL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
4、加入350 µL Buffer N1, 立即反转多次,至溶液充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。
5、室温下13,000 rpm离心10分钟(若上清中有白色沉淀,可再次离心)。
6、小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中(避免吸起沉淀),室温下13,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。
7、可选: 向DNA柱中加入 500 µL Buffer KB, 室温下13,000 rpm 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。
8、向离心柱中加入650 µL DNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇),室温下,13,000 rpm 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“8”。
9、将离心柱放回高速离心机中,13,000 rpm室温下开盖离心2分钟,以彻底去除残留的乙醇。
10、将离心柱转至一个新的1.5 mL离心管中,向DNA柱的正中间加入50~100 µL(体积>50 µL)的ddH2O(pH在7.0-8.5之间)或Elution Buffer,室温放置2分钟,13,000 rpm 离心1分钟,洗脱质粒DNA。将洗脱液再加入到柱中,在13,000 rpm 离心1分钟,收集洗脱液。
质粒小量提取试剂盒操作流程: