保存条件:
RNAse A在4℃下可以保存一年,Buffer A1加入RNase A 后4℃保存,其它组分室温保存。
注意事项:
1、质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时,使用2倍的菌液体积,2倍的Buffer A1,B1,C1,100%乙醇,相同体积的Wash Buffer (70% 乙醇)和Elution Buffer.
2、转化菌:若为-70oC甘油冻存的菌,请先涂布平板培养后,再重新挑选新的单个菌落进行培养。切勿直接取冻存在4oC的菌进行培养。
3、柱结合能力:250 μg
Plasmid Midiprep Kit I质粒中量提取试剂盒操作步骤:
1、培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。
2、加入2.5 mL Buffer A1(确保已加入RNase A),用移液器或涡流震荡确保**沉淀重新悬浮。
3、加入 2.5 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。
4、加入3.0 mL Buffer C1, 立即反转5次,用手用力摇晃3-5次充分混匀,此时出现白色絮状沉淀。
5、将离心管转至高速离心机,在室温下14,000 x g 离心10分钟(若上清中有白色沉淀,可再次离心)。
6、小心吸取离心后的上清液至15 mL管中(避免吸起沉淀),加入3.0 mL 100% 乙醇,立即摇匀,需马上离心过DNA柱。
7、立即转移6.0 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中,室温下> 2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复此步直至所有的溶液通过DNA柱。
8、可选: 向DNA柱中加入 3.0 mL Buffer KB, 室温下> 2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。
9、向离心柱中加入4.0 mL 70% 乙醇,室温下>2,500 x g 离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。
10、将离心柱放回高速离心机中,室温下>2,500 x g 开盖离心10分钟,以彻底去除残留的乙醇。
11、将离心柱转至一个新的15 mL离心管中,向DNA柱膜的正中加入0.5 mL**ddH2O(pH在7.0-8.5之间)或Elution Buffer,室温放置1分钟,>2,500 x g离心5分钟,以洗脱质粒DNA。若想提高得率,将15 mL离心管中的洗脱液再加到柱的中间,>2,500 x g离心5分钟以洗脱质粒DNA。
Plasmid Midiprep Kit I质粒中量提取试剂盒操作流程: