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- 产品名称：无内**快速质粒大量提取试剂盒
- 产品型号：PD1520-01
- 产品展商：Biomiga
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- 发布时间：2018-07-31
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简单介绍
无内**快速质粒大量提取试剂盒（EndoFree plasmid ezFlow maxi kit）处理100-200mL的菌液，可获得500-1000µg的质粒DNA。
产品描述
无内**快速质粒大量提取试剂盒（EndoFree plasmid ezFlow maxi kit）处理100-200mL的菌液，可获得500-1000µg的质粒DNA。
无内**快速质粒大量提取试剂盒组分：
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Catalog #
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PD1520-00
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PD1520-01
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PD1520-02
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Preps
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2
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10
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25
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ezBindTM Columns
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2
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10
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25
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Buffer A1
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer B1
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer N3
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8 mL
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40 mL
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85 mL
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Buffer KB
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer RET
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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RNase A(20 mg/mL)
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2.2 mg
(110μL)
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11 mg
(550μL)
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27 mg
(1.35mL)
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Endofree Elution Buffer
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5 mL
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25 mL
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60 mL
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User Manual
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1
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1
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1
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实验前准备：
1、RNase A：室温下可稳定保存半年，使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1, 使用后将Buffer A1/RNase A置于4oC保存。
2、Buffer B1：在低于室温时会沉淀，请于50oC左右水浴加热至沉淀完全溶解，溶液澄清，使用后保证Buffer B1瓶盖旋紧。
3、准备70%和100%的乙醇。
4、在室温下（22-25℃）进行所有离心操作。
注意事项：
1、质粒拷贝数：纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇，相同体积的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer。
2、转化菌：若为-70℃甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。注意：切勿直接取冻存在4oC的菌进行培养。
3、柱结合能力：1mg
4、对富含内源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，请使用产品PD1713。
无内**快速质粒大量提取试剂盒操作简明步骤：
1、取100 µL新鲜的菌液接种到150-200 mL (勿超过 200 mL)的LB培养基（含适量***），37oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。注：残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分，离心后沉淀较松，不能有效吸取上清。注：本说明书中的操作程序适用于标准LB （Luria Bertani）培养基培养12-16 小时后，OD600（**密度）在2.0-3.0之间的菌液。若采用的是富集培养基，例如TB 或2×YT，请注意保证OD600不超过3.0。
2、加入10 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保**沉淀重新悬浮。 注：不完全悬浮易导致菌体裂解不完全，从而使产量降低。
3、加入 10 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 注：切勿剧烈振荡。静置时间不应超过5分钟，时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到破坏。若溶液未清亮澄清，则表明菌体裂解不充分，应加大Buffer B1的用量或减少菌体量。
4、加入3 mL Buffer N3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
5、将离心管转至高速离心机，在室温下12,000 x g离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。注：低温下RNase不工作，易有RNA污染。如果离心机转子较冷，将离心管在室温下温育10分钟后再离心。若无告速离心机，可用Syringe filter替代(在PD1522中提供，也可单独购买)。
6、转移上清液20 mL（不超过20 mL）至新的50mL离心管中，加入0.5倍体积的Buffer RET (即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET) 及10 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混匀，需马上离心过DNA柱。
7、立即转移20 mL裂解液/收集管至带收集管的DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。将剩余溶液转移至DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复直至所有的溶液通过DNA柱。注：如果50 mL的收集管与离心机转子不符，可在台式离心机> 2,500 x g 离心2分钟。
8、向离心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室温下> 2,500 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“9”。
9、将离心柱放回高速离心机中，室温下5,000 x g开盖离心10分钟，以彻底去除残留的乙醇。注：此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇，乙醇是否去除干净将会影响*后的洗脱效率。若转速低于5,000 x g，需离心20分钟，并可放在空气中晾干。
10、将离心柱转至一个新的50 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer，室温放置1分钟，> 2,500 x g离心5分钟，以洗脱质粒DNA。将50 mL离心管中的洗脱液上柱再放置洗脱1分钟，> 2,500 x g离心5分钟。两次洗脱将提高得率。注：提取到的质粒DNA可用于转染内**敏感性细胞株，原代细胞及用于微注射，建议去除内**。
无内**快速质粒大量提取试剂盒操作流程：
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